2016 Fiscal Year Annual Research Report
新規睡眠制御遺伝子Ｓｌｅｅｐｙの機能解析による睡眠覚醒制御の分子・神経基盤の解明
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15J06369
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
本多 隆利 筑波大学, グローバル教育院, 特別研究員(DC1)
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2015-04-24 – 2018-03-31
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| Keywords | 睡眠 / 覚醒 / フォワード・ジェネティクス / 網羅的行動テストバッテリー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度、申請者の所属する研究室の成果として、フォワード・ジェネティクスの手法により、覚醒時間が大幅に減少するSleepy 変異家系と、レム睡眠が著しく減少する Dreamless 変異家系を樹立し、それぞれの責任遺伝子 (Sik3 およびNalcn) を同定することに成功した（Funato H, Honda T, Yanagisawa M et al., Nature 2016）。申請者は共著者として、ランダム突然変異を導入したマウスの一連の睡眠覚醒表現型スクリーニング・解析に携わった。SIK3蛋白はリン酸化酵素であることから、申請者は睡眠覚醒を制御する細胞内シグナル伝達系の同定を進めている。Sleepy変異家系ではSik3遺伝子のスプライス部位の点突然変異によって、リン酸化部位を含むエクソンがスキップしており、リン酸化部位の欠損により、極端な睡眠時間延長という表現型に至ると予想される。上記仮説を検証するために、リン酸化部位に点突然変異を導入し、１）恒常的に非リン酸化された状態、２）恒常的にリン酸化された状態、を模倣した状態を生体内で再現した遺伝子改変マウスをCRISPR法により作製し、脳波・筋電図（EEG・EMG）測定による睡眠覚醒の表現型を解析、顕著な睡眠異常の表現型を得ている（投稿準備中）。それらの表現型の分子機構を解明すべく、上記２種の遺伝子変異に加え、FLAG/HAタグを導入したマウス個体・培養細胞での免疫沈降法、ウェスタンブロッティング等の生化学的解析により、リン酸化部位への変異導入により、SIK3蛋白との結合パターンの変化する２種類の分子を同定した。合わせて、Sleepy・Dreamless変異家系に対し、網羅的行動テストバッテリーを実施、新規の行動表現型を明らかにし、薬理学・電気生理学実験などを組み合わせて、行動表現型の分子・神経回路基盤の解明を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度、当研究室の成果として、フォワード・ジェネティクスにより、これまで全く知られていなかった、睡眠・覚醒を制御するふたつの遺伝子変異（Sleepy、Dreamless）を見出し、責任遺伝子 (Sik3 およびNalcn) を同定した論文を報告した（Hiromasa Funato, Takato Honda, Masashi Yanagisawa et al., Nature 2016）。申請者は共著者として、一連の睡眠覚醒表現型スクリーニング・解析に貢献した。申請者は計画通りに、目的の２種類の遺伝子改変マウスをCRISPR法により作製完了し、脳波・筋電図（EEG・EMG）解析を進め、顕著な睡眠覚醒異常の表現型を明らかにした。それらの表現型の分子機構を解明すべく、上記２種の遺伝子変異に加え、FLAG/HAタグを導入したマウス個体・培養細胞での生化学的実験により、リン酸化部位への変異がSIK3を中心としたシグナル伝達系にいかに影響を及ぼすかを検証した。その結果、リン酸化部位への変異導入により、SIK3蛋白との結合パターンの変化する２種類の分子を同定した（投稿準備中）。合わせて、Sleepy・Dreamless変異家系に対し、網羅的行動テストバッテリーを実施し、新規の行動表現型を明らかにした。部位・細胞種特異的検証・薬理学・電気生理学実験などを組み合わせて、得られた行動表現型の分子・神経回路メカニズムを記述し得るデータを得ている。その一環で米国マサチューセッツ工科大学（MIT）のin vivo電気生理学を専門とする研究室に留学し、そこで習得した技術を解析手法として組み込むことで、当初の計画よりプロジェクトが発展した。これら新規睡眠覚醒異常マウス家系の行動表現型ならびに分子・神経回路基盤の記述は、睡眠と精神疾患や認知脳機能等との関連性を理解する上で重要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度は、これまで得られた結果を総括し、論文として報告する。引き続き、SIK3を含めた睡眠覚醒を制御する細胞内シグナル伝達系の同定を進める。Sleepy遺伝子末端にFLAGタグをCRISPR法によってknock-inした遺伝子改変マウスの脳組織や、リン酸化部位への変異を導入した培養細胞を用いて、免疫沈降法やウェスタンブロッティングによる生化学的解析を進める。また、Sleepy変異マウスの睡眠過多を引き起こす責任部位および細胞集団を明らかにするため、Sleepy変異によってスキップするエクソンをloxPで挟んだ遺伝子改変マウスを用いる。Creドライバーマウスと交配により、引き続き変異型Sleepy遺伝子の部位・細胞種特異的発現の効果を検討していく。網羅的行動テストバッテリーの結果については、薬理学・電気生理学実験、変異型遺伝子の部位・細胞種特異的発現による効果の検討などを組み合わせて、得られた行動表現型の分子・神経回路基盤の解明ならびに成果報告に努める。
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[Journal Article] Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice2016
Author(s)
Hiromasa Funato, Chika Miyoshi, Tomoyuki Fujiyama, Takeshi Kanda, Makito Sato, Zhiqiang Wang, Jing Ma, Shin Nakane, Jun Tomita, Aya Ikkyu, Miyo Kakizaki, Noriko Hotta-Hirashima, Satomi Kanno, Haruna Komiya, Fuyuki Asano, Takato Honda, Staci J. Kim, Kanako Harano, Hiroki Muramoto, et al., ... and Masashi Yanagisawa
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Journal Title
Nature
Volume: 539
Pages: 378, 383
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Identification of mutations through dominant screening for obesity using C57BL/6 substrains2016
Author(s)
Mohammad Sarowar Hossain, Fuyuki Asano, Tomoyuki Fujiyama, Chika Miyoshi, Makito Sato, Aya Ikkyu, Satomi Kanno, Noriko Hotta, Miyo Kakizaki, Takato Honda, Staci J. Kim, Haruna Komiya, Ikuo Miura, Tomohiro Suzuki, et al., ... Hiromasa Funato and Masashi Yanagisawa
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 6
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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