自然環境における放線菌の生理・生態に関する研究

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J08354
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 河内 護之 東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: 放線菌 / 土壌培養 / 核酸抽出 / Streptomyces griseus

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、1.放線菌土壌培養系の構築、2.放線菌と糸状菌の共培養、3.放線菌の連続的撮影システムの立ち上げの為、以下の要領で研究を実施した。
1.については、はじめに本研究でモデルとして使用する放線菌Streptomyces griseusが、生育可能な土の選定を行った。黒ボク土、灰色低地土、二種類の褐色森林土を用い、放線菌を培養後、実体顕微鏡により生育度合を確認した。その結果、灰色低地土で生育している様子が観察された。さらに電子顕微鏡観察を行った結果、灰色低地土上で胞子形成が観察され、形態分化の誘導も確認された。よって、本研究には今後灰色低地土を用いることとした。続いて、DNA、RNAの抽出の為、抽出キットの検討とそのプロトコールの改良を行った。土壌への核酸吸着を防ぐことが報告されているカゼインによる土壌コーティングとMoBio社製の核酸抽出キットを用いることで、共に抽出が可能になった。抽出DNA・RNAについてPCRおよびRT-PCRについてハウスキーピング遺伝子hrdBもモデルに検証した結果、共に問題なくPCRが実施できた。以上により、土壌培養における生育条件及び核酸抽出条件の検討を完了した。
2,3については、主に菌株の収集と作成を実施した。2については、菌株コレクション等からAspergillus nidulansおよびPenicillium chrysogenumを入手した。A. nidulansについては、環境応答に関与することが予想されるLaeA、VeA遺伝子の欠損株についてもそれぞれ作成を行った。3.については、S.griseusの連続観察系の構築のためにGFPの恒常発現株の作成を実施した。さらに、A-factor生産の連続的観察のためにAfsAプロモーターにGFPを連結した株の作成も実施した。以上により本年度予定していたすべての菌株入手と作成を完了した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初予定していた、S.griseus土壌培養系の立ち上げ及び核酸抽出法の検討並び、放線菌と糸状菌の共培養と放線菌連続観察系に必要な株の入手と作成を現在までに完了している。そのため、おおむね研究は順調に進展していると思われる。ただし、土壌培養系の構築と核酸抽出には予想以上の時間を要したことから、共培養実験や連続観察実験の実施には至らず、計画以上の進展には至らなかった。

Strategy for Future Research Activity

放線菌土壌培養については、生育曲線や形態分化関連遺伝子の発現等を指標にRNA-seqによる網羅的遺伝子発現解析を実施する。その後データ解析により、土壌培養特異的に必要となるような遺伝子群等について推定を行う。
放線菌と糸状菌の共培養については、寒天培地と液体培地で共培養を実施する。形態や色素形成等を指標に詳細な解析を行う放線菌と糸状菌の組み合わせを決定する。その組み合わせで代謝物解析や形態観察を行う。
放線菌の連続観察については、まず連続解析を行う至適条件や方法を構築する。その後、実際に3種類程度の培地で連続観察を実施し、培地による形態分化への影響やA-factor生産の様子の変化について解析する。