Development of a detection system for epigenetic modifications using enzyme fused zinc finger protein

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J08615
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 李 鎭煕 東京農工大学, 大学院工学府, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: DNAメチル化 / 診断 / エピジェネティック修飾 / ジンクフィンガー蛋白質 / アルカリフォスファターゼ

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではDNAのメチル化やヒストンのアセチル化といった種々のエピジェネティック修飾を、がんをはじめとする種々の疾患の早期・術中診断の指標として利用することを想定し、アルカリフォスファターゼ融合ジンクフィンガー蛋白質（ALP融合ZFP）の開発、及びそれを用いた検出システムの開発を目的とし、研究を進めた。
平成28年度はまず、ALP融合ZFPの標的DNAへの結合能の評価及びALP活性の詳細な評価を行った。ALPのN末端にZFPを融合した場合約2 nM程度のKdが、C末端に融合した場合では約1 nM程度のKdが算出された。このことから、いずれの末端に融合した場合でもZFPは十分な結合能を保持していることが分かった。また、ALP活性を、pNPPを基質として算出したところ、それぞれ約50 U/mg、及び約45 U/mgとなった。このことから、融合する末端の違いはALP活性にはあまり影響しないことが分かった。
また、グルコース脱水素酵素を融合したZFPを用いたメチル化DNAの検出法の開発も試みた。結果として、従来法より短い時間で、前立腺がんの診断の指標となる遺伝子領域におけるDNAメチル化レベルの検出に成功した。本結果については診断分野の最高峰の学術誌であるBiosensors and Bioelectronics誌に報告した。今後、より簡便かつ高感度なエピジェネティック修飾の検出法開発が期待できる。
一方で、リヨン第一大学のLoic. J. Blum教授との共同研究により、ALP融合ZFPを用いて複数の標的DNAを同時に検出するためのシステムの開発も進めており、こちらは平成29年度中の論文投稿を目指す。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

アルカリフォスファターゼを融合したジンクフィンガー蛋白質の詳細な特性を評価し、標的DNAの検出に成功していること、また、グルコース脱水素酵素を融合したジンクフィンガー蛋白質を用いたDNAのメチル化の電気化学的な検出法の開発にも成功していることを踏まえ判断した。

Strategy for Future Research Activity

今後は、特性評価を行ったアルカリフォスファターゼ融合ZFPを用いて実際にエピジェネティック修飾の検出を試みる。最終的には小型の電極を用いた簡便な診断用のセンサーの構築を目指す。
リヨン第一大学のLoic. J. Blum教授との共同研究により、ALP融合ZFPを用いて複数の標的DNAを同時に検出するためのシステムの開発も進めており、こちらは平成29年度中の論文投稿を目指す。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Universite Claude Bernard Lyon 1(フランス)
  • Country Name: FRANCE
  • Counterpart Institution: Universite Claude Bernard Lyon 1
• [Journal Article] Development of an electrochemical detection system for measuring DNA methylation levels using methyl CpG-binding protein and glucose dehydrogenase-fused zinc finger protein (2016)
  • Author(s): Jinhee Lee, Wataru Yoshida, Koichi Abe, Kazuhiko Nakabayashi, Hironobu Wakeda, Kenichiro Hata, Christophe A. Marquette, Loic J. Blum, Koji Sode, Kazunori Ikebukuro
  • Journal Title: Biosensors and Bioelectronics Volume: 93 Pages: 118-123
  • DOI: http://doi.org/10.1016/j.bios.2016.09.060
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] DNA aptamers against FokI nuclease domain for genome editing applications (2016)
  • Author(s): Maui Nishio, Daisuke Matsumoto, Yoshio Kato, Koichi Abe, Jinhee Lee, Kaori Tsukakoshi, Ayana Yamagishi, Chikashi Nakamura, Kazunori Ikebukuro
  • Journal Title: Biosensors and Bioelectronics Volume: 93 Pages: 26-31
  • DOI: http://doi.org/10.1016/j.bios.2016.11.042
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 標的DNA検出に向けたアルカリフォスファターゼ融合ジンクフィンガー蛋白質の開発 (2017)
  • Author(s): 李 鎭煕, Christophe A. Marquette, Loic J. Blum, 塚越 かおり, 早出 広司, 池袋 一典
  • Organizer: 電気化学会第84回大会
  • Place of Presentation: 首都大学東京（東京都八王子市）
  • Year and Date: 2017-03-25 – 2017-03-27
• [Presentation] Development of detection system for epigenetic modifications by enzyme fused zinc finger protein (2016)
  • Author(s): Jinhee Lee, Wataru Yoshida, Daisuke Hiraoka, Aki Kezuka, Atsuro Tatsumi, Yuko Osawa, Koichi Abe, Kazuhiko Nakabayashi, Hironobu Wakeda, Kenichiro Hata, Koji Sode, Kazunori Ikebukuro
  • Organizer: PRiME2016
  • Place of Presentation: USA (Hawaii)
  • Year and Date: 2016-10-02 – 2016-10-07
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of detection system for epigenetic modifications by enzyme fused zinc finger protein (2016)
  • Author(s): Jinhee Lee, Wataru Yoshida, Daisuke Hiraoka, Aki Kezuka, Atsuro Tatsumi, Yuko Osawa, Koichi Abe, Kazuhiko Nakabayashi, Hironobu Wakeda, Kenichiro Hata, Koji Sode, Kazunori Ikebukuro
  • Organizer: Biosensors2016
  • Place of Presentation: Sweden (Gothenburg)
  • Year and Date: 2016-05-25 – 2016-05-27
  • Int'l Joint Research