2015 Fiscal Year Annual Research Report
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15J08667
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
末岡 拓馬 東京大学, 工学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| Keywords | ヒストン / タンパク質化学合成 / Native chemical ligation / ヌクレオソーム / 生細胞イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成27年度は、固相合成とNative chemical ligationによるヒストンH2Aの化学合成に加え、翻訳後修飾の影響を調べるためのアッセイを行った。内容は、化学合成法によるヒストンタンパクの作製、細胞内に人工合成したヒストンを導入する手法の確立、試験管内でのヌクレオソーム再構成と翻訳後修飾の安定性評価の3点からなる。
第一のヒストンの化学合成に関しては、基本的には前年までに確立した合成ルートを用いている。今回は複数修飾（リン酸化セリン、メチル化リシン、アセチル化リシン）を含むヒストンを合成した。
第二に、外部から細胞内へのヒストンの導入法について述べる。細胞内でのヒストンの挙動を観察する目的のために、N末端に蛍光色素を標識したヒストンH2Aを化学合成し、その導入を試みた。特別な操作を施さないトランスフェクション実験では標識H2Aがエンドソームから脱出できていない様子が観察された。そのため、ビーズローディングと呼ばれる高分子導入法を用いて実験を行ったところ、標識ヒストンは細胞の核内に移行したことが示された。
第三に、試験管内でヌクレオソームの安定性の評価を行った。合成したヒストンH2Aを用いて、翻訳後修飾を含む・含まないヌクレオソームを作製した。SYPRO Orangeと呼ばれる蛍光色素を加えてサーマルシフトアッセイを行うことで、翻訳後修飾がヌクレオソームの安定性にどの程度影響を与えるかを検証した。その結果、今回導入した修飾は安定性には影響しないことが分かったが、評価方法の確立は進めることができた。
上で述べた実験を経ることで化学合成したヒストンH2Aが生物由来のヒストンH2Aと同様にアッセイ可能であることが明らかとなり、タンパクの化学合成がエピジェネティクス研究を推進するうえで強力なツールとなることを実証した。また、これまでの研究結果を英国王立化学会のChem. Commun.誌に投稿し、受理されることが決まった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成27年度の当初の計画では、翻訳後修飾を含むヒストンH2Aを合成することと、蛍光標識したヒストンによる生細胞イメージングが盛り込まれていた。研究実績の概要で述べたとおり、蛍光標識ヒストンH2Aを細胞内に導入する方法を検証し、ビーズローディング法によってそれが可能であることを確かめた。一般に外部からタンパク質を細胞内に導入することは困難であり、本研究の大きな課題であったことから、これを克服したのは確かな進展だと考えている。
また、イメージングとは別に、試験管内でヌクレオソームの安定性を評価することが可能となった。以前の研究では、翻訳後修飾がヌクレオソームの安定性に与える影響を調べるためにはFRETを起こす蛍光色素のペアを導入するなどの多段階・煩雑な合成実験が必要であった。今回のSYPRO Orangeを用いる方法では、作製したヌクレオソームに色素を溶かした溶液を加えるのみでよく、非常に簡便である。
これらの研究結果を踏まえると、本研究は計画以上に進展しているであろうといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、翻訳後修飾とヒストンのダイナミクスを追跡するにあたって、まずはメインターゲットとする翻訳後修飾の選択が肝心になる。現時点では、ヒストンH2Aに近年発見されたチロシンのリン酸化が良い対象だと考えている。チロシンリン酸化は転写の伸長に関わることが分かっているが、それに関連するタンパク質の同定などは進んでいない。また、この修飾がH2Aのグロビュラードメインになされるため、ヌクレオソームの安定性にかなりの影響を与えることが期待される。よって、本研究の持つ化学合成の強みを生かすことで、リン酸化修飾の機能解明に寄与できるのではないかと考えている。
加えて、イメージングの実験を引き続き行う予定である。平成27年度では合成ヒストンが核内に局在することは確かめられたが、それ以外の移行の様子は観察できていない。試験管内でのアッセイと組み合わせてより細かい条件設定をしていきたいと考えている。
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