2015 Fiscal Year Annual Research Report
新規阻害剤を用いた巨大ＡＴＰａｓｅミダシンによるリボソーム生合成の制御機構の解明
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15J09028
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
青井 勇樹 東京大学, 薬学系研究科, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| Keywords | リボソーム / ATPase / ミダシン / 阻害剤 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、ゲノム情報をタンパク質に変換する翻訳装置リボソームが細胞内で生合成される仕組みを解き明かすことを目的とする。リボソームの成熟過程において、巨大なATP加水分解酵素ミダシン（Mdn1）がどのような機能をもつのかを調べるうえで、初年度では以下のような成果が得られた。
（１）これまで分裂酵母を用いた内在性Mdn1タンパク質の発現量解析や、Mdn1を含むリボソーム前駆体pre-60Sの単離・精製が困難であったため、これらを実現させる実験系の構築を目指した。検討の結果、Mdn1のN末端にリンカー配列を挟んでGFPタンパク質を融合させたタンパク質を、内在性Mdn1プロモータの制御下でゲノムから発現させることにより、約570 kDaの巨大なGFP-Mdn1タンパク質をウェスタンブロッティングによって簡便に検出できるようになった。さらに、抗GFP抗体による免疫沈降により、細胞抽出液からGFP-Mdn1を含むpre-60S複合体を効率よく単離・精製することが可能となった。
（２）米ロックフェラー大との共同研究の結果、in vitroで低分子化合物RBin-1がMdn1のATP加水分解活性を阻害することがわかり、RBin-1がMdn1の阻害剤であることが証明された。しかし、RBin-1はMdn1の活性を最大で約50%までしか阻害できなかった。申請者のこれまでの解析によりMdn1は活性のあるATP加水分解ドメインを4つ持つことがわかっている。したがってRBin-1は、4つのATP加水分解ドメインの全てを阻害することはできないが、ある特定のドメインを特異的に阻害することが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度での主な目標であった（１）分裂酵母細胞からのMdn1タンパク質の精製法の確立と、（２）低分子化合物RBin-1がMdn1の阻害剤であること可能性の追究、の２点をどちらも達成したため、研究は概ね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は主に以下の３点について研究を推進させる。
（１）pre-60S複合体の構成因子のなかで、Mdn1の酵素活性によって複合体との相互作用が制御される因子を探索する。具体的には、RBin-1で処理した細胞からGFP-Mdn1を含むpre-60S複合体を単離し、未処理の細胞由来のpre-60S複合体と比較することにより、化学量論的に変化のあった因子をLC-MS/MS解析を用いて同定する。
（２）申請者の過去の解析によりMdn1との関連が示唆されているシャペロンタンパク質HSP70が、pre-60Sの複合体形成に関わる可能性を検討する。HSP70のATP加水分解活性を薬剤で特異的に阻害した場合に、GFP-Mdn1を含むpre-60S複合体の構成因子のなかで複合体との相互作用に変化がみられるかを調べる。
（３）減数分裂期におけるリボソーム生合成を調べるため、減数分裂をおこなう酵母細胞をRBin-1で処理し、ライブイメージングによる細胞生物学的な解析をおこなう。
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