第３世代の閉塞性肺疾患モデルを用いた新規創薬ターゲットの探索及びその評価

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15J09420
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 亀井 竣輔 熊本大学, 生命科学研究部, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2015-04-24 – 2018-03-31
• Keywords: 第3世代βENaC-Tgマウス / 亜鉛トランスポーターZIP2 / スプライシング異常 / トランスクリプトームアレイ / lncRNA / ZIP2欠損気道上皮細胞 / ZIP2過剰発現気道上皮細胞

Outline of Annual Research Achievements

本研究者はこれまで，閉塞性肺疾患モデルマウスである第2世代βENaC-Tgマウス（C57BL/6-βENaC-Tg）から見出した，亜鉛トランスポーターZIP2のスプライシング異常に関しての解析を行ってきた．また同時に，第2世代βENaC-Tgマウスと比較して，よりヒトの閉塞性肺疾患病態を模擬した第3世代βENaC-Tgマウス（βENaC-Tg / SMP30 KOマウス）の作製にも成功した．そこで今年度は，ZIP2のスプライシング異常などの病態メカニズム解明を第3世代βENaC-Tgマウスへと展開すべく，病態メカニズムに関する詳細な検討を行った．
病態モデルの気道上皮細胞を用いた全転写産物解析（トランスクリプトームアレイ）を行うことで，これまで同定したZIP2の発現制御に関わる分子や新規の病態増悪に関連する分子の探索を行った．その結果，新たな病態関連因子として複数の非コード長鎖RNA（lncRNA）を同定した．また，ZIP2およびスプライシング異常に伴い産生されるZIP2スプライシングバリアントの詳細な機能解析を行うべく，それぞれの過剰発現およびノックアウト細胞系の確立を行った．
今後，上記の遺伝子改変気道上皮や第3世代βENaC-Tgマウスを用いて，スプライシング異常やlncRNAの発現制御異常などの閉塞性肺疾患の新規病態メカニズムをより詳細に解明していくことで，閉塞性肺疾患病態の新規創薬標的の提案を目指す．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

現在，機能解析を目的としたZIP2の過剰発現およびノックアウト気道上皮細胞の確立も概ね順調に進んでおり，次年度には機能解析を完了することが可能である．また，ユニークな病態関連因子として，新規にlncRNAを同定することができた．

Strategy for Future Research Activity

次年度は，閉塞性肺疾患で特異的に変動するlncRNAが，ZIP2の発現制御や病態増悪の各種シグナルおよび分子に関与するかを解明すべく，lncRNA過剰発現やノックアウト気道上皮細胞の構築を行う．また，現在構築段階であるZIP2・ZIP2スプライシングバリアントのCRISPR-Cas9システムによるノックアウトおよびレンチウイルスを用いた過剰発現気道上皮細胞株を用いて，閉塞性肺疾患病態に関与する分子の発現や活性を評価する．

なお，上記の検討事項を踏まえた上で，実際に第3世代βENaC-Tgマウスを用いて，これまでの検討結果が本マウスでも観察されるかを確認する．同時に，これらの現象が，第3世代βENaC-Tgマウスの呼吸器病態に変化を及ぼすか否かについて明らかにするために，ノックダウン等を用いた評価およびスプライシング阻害剤投与などの薬理学的評価を併せて行う．

Research Products

• [Presentation] 嚢胞性線維症の原因遺伝子 CFTR の機能に依存した lncRNA の発現変動とその機能解析 (2016)
  • Author(s): 亀井 竣輔, 首藤 剛, 丸田 かすみ, 藤川 春花, 野原 寛文, 中嶋 竜之介, 田崎 幸裕, 首藤 恵子, Mary Ann Suico, 甲斐 広文
  • Organizer: 第136回日本薬学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川）
  • Year and Date: 2016-03-26 – 2016-03-29
• [Presentation] 亜鉛トランスポーターZIP2の新規スプライスアイソフォームによる嚢胞性繊維症の肺病態形成機構 (2016)
  • Author(s): 首藤 剛, 亀井 竣輔, 首藤 恵子, スイコ メリーアン, 甲斐 広文
  • Organizer: 第93回日本生理学会大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（北海道）
  • Year and Date: 2016-03-22 – 2016-03-24
  • Invited
• [Presentation] 新規閉塞性肺疾患モデルマウスから見出した亜鉛トランスポーターの発現制御異常 (2016)
  • Author(s): 亀井 竣輔, 首藤 剛, 甲斐 広文
  • Organizer: 第89回日本薬理学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川）
  • Year and Date: 2016-03-09 – 2016-03-11
  • Invited
• [Presentation] A novel splicing variant of zinc transporter ZIP2 controls the pathology of CF and CF-like airway diseases (2015)
  • Author(s): S. Kamei, T. Shuto, K. Shuto, H. Fujikawa, K. Maruta, H. Nohara, R. Nakashima, M. Suico, D.C. Gruenert, H. Kai
  • Organizer: 2015 Cell Biology ASCB Annual Meeting
  • Place of Presentation: San Diego, CA
  • Year and Date: 2015-12-12 – 2015-12-16
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 嚢胞性繊維症の気道上皮において発現変動する機能未知IncRNAの解析 (2015)
  • Author(s): 亀井 竣輔, 首藤 剛, 丸田 かすみ, 野原 寛文, 藤川 春花, 中嶋 竜之介, 田崎 幸裕, 首藤 恵子, Mary Ann Suico, 甲斐 広文
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会・第88回日本生化学会大会合同大会（BMB2015）
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 閉塞性肺疾患モデルにおける亜鉛トランスポーターZIP2の新規スプライシングアイソフォーム発現に関する解析 (2015)
  • Author(s): 亀井 竣輔, 首藤 剛, 首藤 恵子, 藤川 春花, 丸田 かすみ, 野原 寛文, 中嶋 竜之介, 松本 千鶴, 坂口 由起, Mary Ann Suico, 甲斐 広文
  • Organizer: 第37回生体膜と薬物の相互作用シンポジウム
  • Place of Presentation: 熊本大学薬学部（熊本）
  • Year and Date: 2015-11-19 – 2015-11-20
• [Presentation] A novel splicing variant of zinc transporter ZIP2 controls the pathology of CF and CF-like airway diseases (2015)
  • Author(s): S. Kamei, T. Shuto, K. Ueno-Shuto, H. Fujikawa, K. Maruta, H. Nohara, R. Nakashima, C. Matsumoto, Y. Sakaguchi, M. Suico, D.C. Gruenert, H. Kai
  • Organizer: International Symposium on Chronic Inflammatory Diseases 2015
  • Place of Presentation: Kumamoto, Japan
  • Year and Date: 2015-10-16 – 2015-10-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] CFTR-dependent dysregulation of specific lncRNAs with unknown function in cystic fibrosis airway epithelial cells (2015)
  • Author(s): S. Kamei, K. Maruta, T. Shuto, H. Fujikawa, H. Nohara, R. Nakashima, Y. Tasaki, K. Ueno-Shuto, M. Suico, D.C. Gruenert, H. Kai
  • Organizer: International Symposium on Chronic Inflammatory Diseases 2015
  • Place of Presentation: Kumamoto, Japan
  • Year and Date: 2015-10-16 – 2015-10-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 閉塞性肺疾患モデルにおける亜鉛トランスポーターZIP2の新規スプライシングアイソフォーム発現上昇とその意義 (2015)
  • Author(s): 亀井 竣輔, 首藤 剛, 首藤 恵子, 藤川 春花, 野原 寛文, 丸田 かすみ, 松本 千鶴, 坂口 由起, Mary Ann Suico, 甲斐 広文
  • Organizer: 第8回トランスポーター研究会九州部会
  • Place of Presentation: 鹿児島大学医学部鶴陵会館（鹿児島）
  • Year and Date: 2015-07-18
• [Presentation] 嚢胞性線維症の気道上皮における機能未知IncRNAの発現変動 (2015)
  • Author(s): 亀井 竣輔, 丸田 かすみ, 首藤 剛, 野原 寛文, 藤川 春花, 中嶋 竜之介, 首藤 恵子, Mary Ann Suico, 甲斐 広文
  • Organizer: 第8回トランスポーター研究会九州部会
  • Place of Presentation: 鹿児島大学医学部鶴陵会館（鹿児島）
  • Year and Date: 2015-07-18
• [Presentation] 閉塞性肺疾患モデルにおける亜鉛トランスポーターZIP2の新規スプライシングアイソフォーム発現上昇とその意義 (2015)
  • Author(s): 亀井 竣輔, 首藤 剛, 首藤 恵子, 藤川 春花, 野原 寛文, 丸田 かすみ, 松本 千鶴, 坂口 由起, Mary Ann Suico , 甲斐 広文
  • Organizer: 第10回トランスポーター研究会年会
  • Place of Presentation: 慶応義塾大学（東京）
  • Year and Date: 2015-06-20 – 2015-06-21
• [Remarks] 熊本大学大学院 薬学教育部 遺伝子機能応用学研究室
  • URL: http://molmed730.org/
• [Remarks] 熊本大学薬学部 / 大学院薬学教育部
  • URL: http://www.pharm.kumamoto-u.ac.jp/
• [Remarks] 熊本大学 博士課程教育リーディングプログラム HIGOプログラム
  • URL: http://higoprogram.jp/