2016 Fiscal Year Annual Research Report
ゼニゴケを用いた新しい相互作用タンパク質探索技術の開発
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15J09907
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
田中(坪山) 祥子 東京農工大学, 大学院連合農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2019-03-31
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| Keywords | タンパク質間相互作用 / ゼニゴケ / 形質転換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度では、本技術に用いるためのBaitである青色光受容体フォトトロピンとウミシイタケルシフェラーゼのN末端断片を融合させたタンパク質(PHOT-NLuc)を発現する形質転換ゼニゴケの作成と、Preyに用いるゼニゴケcDNAライブラリーの構築を行う予定であった。
本年度は、ゼニゴケにおけるルシフェラーゼの機能を確認するために、まず、ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ(Rluc)の全長を発現する形質転換ゼニゴケを作出し、その発光強度を検証した。しかし、発光が確認されないか、非常に弱い発光のみが確認されたため、他の生物由来のルシフェラーゼに変更することにした。次に、トゲオキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼ(Nluc) の全長を発現する形質転換ゼニゴケを作出したところ、強い発光が確認されたため、本技術の開発には、Nlucを用いることにした。
また、本技術は、新規タンパク質のスクリーニングへの利用を目的としているため、高効率な形質転換法は必須である。そのため、本年度は報告者が開発したゼニゴケの簡便な形質転換法であるアガートラップ法の改良を行い、さらなる高効率化を目指した。アガートラップ法の改良では、アグロバクテリウム株の菌株による形質転換効率の差を比較した。さらに、アグロバクテリウムとの共存培養時に、シャーレをパラフィルムで巻くことで、培養室内が乾燥していても、効率的な形質転換を行えるようになった。これらの改良で、これまで約50%であった形質転換効率を90%以上に上げることに成功し、スクリーニングに用いる為に、充分な効率の形質転換系を確立出来たと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は年度途中からの採用再開だったため、平成28年10月から平成29年3月までの半年間の研究進歩状況を報告する。当初の計画では、本技術に用いるためのBaitと、Preyに用いるゼニゴケcDNAライブラリーの構築を行う予定であった。本技術の開発には、当初ウミシイタケ由来ルシフェラーゼ(Rluc)を用いる予定であったが、予備実験であるゼニゴケにおけるルシフェラーゼの機能の確認において、Rlucでは弱い発光しか確認されなかったため、本技術の開発には適さないと考えられた。次に、トゲオキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼ(Nluc)を用いたところ、強い発光が確認されたため、本技術の開発にはNlucを用いることに変更した。また、本年度は本技術に用いる形質転換法の改良に成功し、非常に高効率なゼニゴケ形質転換が可能になった。本技術に用いるルシフェラーゼの変更はあったが、本技術の基盤技術である高効率なゼニゴケ形質転換法の確立には成功したため、本技術の開発はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
ゼニゴケにおいてNlucの強い発光を確認出来たことから、NlucのPCA法として報告されているNanoBitがゼニゴケにおいて機能するかを確認するため、モデル実験としてホモダイマーを形成するMXMTタンパク質、ゼニゴケ由来青色光受容体フォトトロピン(PHOT)およびヘテロダイマー形成するFKBP-FRB相互作用を用いて検証を行う。
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