2016 Fiscal Year Annual Research Report
タンパク質特異的修飾を指向した新規タンパク質チオエステル合成法の開発
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15J09928
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
津田 雄介 徳島大学, 大学院薬科学教育部, 特別研究員(DC1)
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2015-04-24 – 2018-03-31
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| Keywords | ペプチドチオエステル / Native Chemical Ligation / 武装抗体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、タンパク質特異的修飾を指向した新規タンパク質チオエステル合成法の開発を目的とする。
近年、疾病に関与する細胞を認識する抗体と生物活性小分子を結合させた武装抗体が注目を集めている。現在汎用されている抗体と小分子化合物を結合させる手法では選択性に問題があるため、化学的に均一な武装抗体を得ることが困難である。この問題の解決法として申請者は、ペプチドチオエステルとN末端Cys含有ペプチドの化学選択的な縮合反応であるNative Chemical Ligation (NCL) 法が利用可能だと考えた。そこで申請者は発現タンパク質に適用可能なタンパク質チオエステル合成法を開発し、本手法を用いて調製したチオエステル化抗体と小分子化合物を導入したN末端Cys含有化学合成フラグメントのNCLにより、化学的に均一な武装抗体を合成することとした。
申請者は現在までにNi(II)に配位する4残基のアミノ酸からなるタグ配列を有する化学合成したペプチドのチオエステルへの変換に成功している。そこで今年度、申請者は上記の配列特異的チオエステル化反応のタンパク質レベルでの確立を目指した。本反応はメタノール含有水溶液中にて行うため、タンパク質の溶解性に影響を与えることが予測された。そこで申請者は、特定の刺激により切断可能なリンカー分子を介し、タンパク質を樹脂上へと担持した状態で配列特異的チオエステル化反応に付すことで溶解性の問題を克服可能だと考えた。そして種々検討の結果、還元条件により切断可能なジスルフィドリンカーを開発し、モデルペプチドを用いた樹脂上での配列特異的チオエステル化反応に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度はタンパク質への適用が期待される樹脂上での配列特異的チオエステル化反応にペプチドレベルにて成功した。具体的には様々な刺激に応答して切断されるリンカー分子の合成を通じ、還元条件により切断可能なジスルフィドリンカーを見出した。そして得られたジスルフィドリンカーの構造改変により切断速度が向上した新規ジスルフィドリンカーを得ることに成功した。また本リンカー分子を介し、モデルペプチドを樹脂上へと担持し、前年度に開発した配列特異的チオエステル化反応に付したのち、還元条件に付すことでペプチドチオエステルを得ることに成功した。本手法を用いることで発現タンパク質の溶解性への影響が懸念されるメタノール含有水溶液中における配列特異的チオエステル化が可能となることが期待される。これらの研究実施状況より、平成28年度の研究はおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に開発したジスルフィドリンカーを用いた樹脂上での配列特異的チオエステル化反応および樹脂からの溶出が発現タンパク質に適用可能か検証する。具体的には樹脂への発現タンパク質への吸着から溶出までの各段階における反応条件の検討および種々発現タンパク質を用いた汎用性の検証を行う。続いて本手法を用い、抗体に生物活性小分子を導入した武装抗体を合成し、その活性評価を行う。具体的には、本手法を用いがん細胞特異的な抗体をチオエステル化した後、CXCL14拮抗剤を導入した化学合成フラグメントとのNCLに付すことで、抗体の化学修飾を行う。申請者の所属する研究グループにおいて、ケモカインの一種であるCXCL14の拮抗剤が開発されている。CXCL14は腫瘍悪性化に関与することが示唆されているため、がん細胞特異的な抗体とCXCL14拮抗剤との複合体が、がん細胞のみに対し強力な抗がん活性を示すと考えた。
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