2018 Fiscal Year Annual Research Report
脱ユビキチン化酵素ＵＳＰ９Ｘによるインスリン受容体基質量制御とがん悪性化の新機構
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15J10937
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
古田 遥佳 東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2020-03-31
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| Keywords | USP9X / IRS-2 / IGF-I / Erk1/2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでの研究から、私は、IRS-2を高発現するヒト前立腺がん細胞株PC3において、USP9XはIRS-2を脱ユビキチン化することにより 分解を抑制、IRS-2のタンパク質レベルを高く維持し、その結果IGFシグナル下流のErk1/2経路を活性化していることが明らかにしてきた。
今年度は、これまでの成果をOncotarget誌に投稿し、掲載に至った。また今年度は相互作用解析が可能かつより効率的なIRS-2、USP9Xの精製方法の検討を行った。その結果IRS-2とUSP9XをそれぞれHEK293T細胞と大腸菌で別々に精製することが可能となり、これまでより大量に安定してタンパク質を得ることが出来るようになった。今後この系を用いてAlpha-screenを用いた低分子化合物スクリーニングを進めていく。またこれまでUSP9XによるIRS-2の高発現の維持がどのような機構でErk1/2経路の活性化を維持するのかは不明であった。そこで本年度は、IRS-2の高発現がErk1/2経路の恒常的な活性化を起こす機構の解明を行った。PC3細胞は、成長因子を全く含まない無血清培地で培養した際にもErk1/2経路の恒常的な活性化が観察され、この活性化はIGF-Iに対する中和抗体の添加で低下した。この結果から、PC3細胞は培地中にIGF-Iを分泌しており、それがErk1/2の活性化に不可欠であることが示唆された。またIRS-2の発現抑制によりPC3細胞の無血清培地培養条件下でのErk1/2のリン酸化は低下するが、IRS-2発現抑制細胞を、発現抑制していないPC3細胞を培養した無血清培地で培養すると低下していたErk1/2のリン酸化が回復した。これらの結果から、IRS-2はIGFシグナル仲介分子としてだけでなく、IGF-Iの活性発現に必要な液性因子の分泌、または活性化にも必要であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに私は、PC3細胞において脱ユビキチン化酵素であるUSP9XがIRS-2と相互作用し、IRS-2の分解 を抑制することによりその高発現を維持していることを明らかとした。本研究では、USP9XがIRS-2の高発現を維持することによりIGF シグナルが過増強し、がんの形質を獲得、維持していることを証明することを目的とした。さらに、USP9XとIRS-2との結合を阻害する 低分子化合物を同定し、新しい抗がん剤の開発につなげる。
USP9XとIRS-2の結合様式については、本年度の成果によりIRS-2とUSP9XをそれぞれHEK293T細胞と大腸菌で別々に精製し両者の結合を観察することが可能となった。現在この系を用いて、IRS-2とUSP9Xとの結合を阻害する低分子化合物スクリーニングを進めている。USP9XによるIRS-2の高発現がIGFシグナルを過増強する機構については、PC3細胞は、成長因子を全く含まない無血清培地で培養した際にもErk1/2経路の恒常的な活性化が観察され、種々の解析からPC3細胞は培地中にIGF-Iを分泌し、それがErk1/2の恒常的なリン酸化に必須であることが示唆された。更に、IRS-2の発現抑制によりこの無血清培地培養条件下でのErk1/2のリン酸化は低下するが、IRS-2発現抑制細胞を、発現抑制していないPC3細胞を培養した無血清培地で培養すると低下していたErk1/2のリン酸化が回復した。これらの結果から、IRS-2はIGFシグナル仲介分子としてだけでなく、IGF-Iの活性発現に必要な液性因子の分泌、または活性化にも必要であることが示唆され、現在この液性因子の同定を進めている。本年度はこれまでの成果をOncotarget誌に公表できたことも合わせ、研究はおおむね順調に進んでいると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度は、USP9XとIRS-2をそれぞれHEK293T細胞と大腸菌を用いて別々に精製し、両者の結合を検出することに成功した。今後は、今年度確立した精製方法で精製したUSP9XとIRS-2を低分子化合物（理化学研究所期間研究室ケミカルバイオ ロジー部門が有する35.000種類の化合物）存在下・非存在下でインキュベートした後、Alpha-Screen系でスクリーニング解析を行い、 USP9XとIRS-2との結合に変化を与える低分子化合物を同定する。この研究により、USP9XとIRS-2 との結合をターゲットとした新たな抗がん剤の開発につなげる。
今年度はまた、USP9XによるIRS-2の高発現がIGFシグナルを過増強する機構について解析し、IRS-2はIGFシグナル仲介分子としてだけでなく、IGF-Iの活性発現に必要な液性因子の分泌/活性化にも必要であることが示唆された。今後は、IGF-I活性発現調節に関わる分子の量および活性を、IRS-2の発現抑制を行う/行わないPC3細胞の培養上清間で比較し、IRS-2が分泌/活性化に関わる液性因子の同定を行う。更に同定した液性因子をPC3細胞において発現抑制し、無血清培地で培養したのちErk1/2のリン酸化を解析することにより、同定した因子がPC3細胞のErk1/2の活性化に重要であることを示す。またこれまでの解析から、PC3細胞のErk1/2のリン酸化はがん形質である足場非依存性増殖能に必要であることが明らかとなっているため、同定した液性因子の発現抑制がPC3細胞の足場非依存性増殖能に与える影響についても同様に評価する。これらの解析により、IRS-2の高発現ががん形質の維持に寄与する分子機構を明らかにし、がんにおけるUSP9XによるIRS-2の高発現の維持の重要性を更に示す。
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Research Products
(1 results)
