2015 Fiscal Year Annual Research Report
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15J11568
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| Research Institution | Meiji University |
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Principal Investigator |
上春 浩貴 明治大学, 農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| Keywords | 下垂体 / 幹細胞 / Cre |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、成熟下垂体に存在する下垂体幹細胞から各種ホルモン産生細胞が供給されていることが報告された。このことより、成熟下垂体の機能維持に幹細胞が重要であることが明らかになりつつある。しかし、我々の先行研究では、胎仔期と成熟後の下垂体幹細胞では性質が異なる可能性を見出している。この違いを明らかにすることで下垂体の機能維持の解明につながると考え、本研究では、下垂体幹細胞で時空間的な発現変動が確認されているPROP1,PRRX1,PRRX2,S100bに注目し、Cre/LoxPシステムを用いた細胞系譜追跡実験を計画した。この実験では、各遺伝子の発現下でタモキシフェン誘導性のリコンビナーゼCreERT2を発現する遺伝子改変動物を作製し、タモキシフェン投与時にそれぞれの遺伝子を発現している細胞でのみリコンビネーションを誘導することで、時期特異的な細胞系譜の追跡を行うことが可能である。研究課題初年度では、以下の内要の実験を実施した。
・それぞれの遺伝子の転写調節領域を含むBAC Cloneを用いて、開始コドンを含むエキソンの開始コドンより下流をCreERT2遺伝子に組み替えた。組み替えは、Red/ETシステムを用いて行った。
・S100b,PRRX1のプロモーター下にCreERT2を組み込んだBAC Cloneを用いて遺伝子改変動物の作製を行った。また、その表現型の確認を行い、下垂体でCreERT2が発現している遺伝子改変動物が作製できていることを確認した。
・タモキシフェンを投与した際にリコンビネーションが誘導されるかin vivoにおける解析を行ったが、リコンビネーションは確認されなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初年度の実験で、タモキシフェン投与量と投与時期の設定までを計画していた。
しかし、タモキシフェン投与を行ってもリコンビネーションが確認されず、投与量の検討が行えていない。また、表現型に関して、Creに対する特異抗体を用いた免疫染色を行ったが、特異的なシグナルは得られていないため、標的細胞特異的にCreERT2が翻訳されているか判断できていない。このCre抗体は、ポジティブコントロールとして使用したCAG-Creラットでは特異的なシグナルが得られているため、ERT2が結合していることにより抗原部位が隠れている可能性を考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
タモキシフェンによるCreERT2のリコンビネーションの誘導は、生体内で代謝された4-ヒドロキシタモキシフェンにより行なわれていることが知られている。しかし、ラットでの4-ヒドロキシタモキシフェンの代謝量は、マウスに比べて低いとの報告もある。そこで、リコンビネーションを起こしているか確認するために、作製した遺伝子改変動物を使用した下垂体初代培養細胞に4-ヒドロキシタモキシフェンを添加した際のリコンビネーションの確認を行う。加えて、ラットでのタモキシフェンの致死量を調査した上で、タモキシフェンを大量に投与した際のリコンビネーションの確認を実行する。これらを実行することで、タモキシフェンによりリコンビネーションが誘導されているか検証する。
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Research Products
(9 results)
