2015 Fiscal Year Annual Research Report
海綿動物を起源とする複雑骨格天然物の生合成マシナリーの解明
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15J12340
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
中嶋 優 東京大学, 薬学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2018-03-31
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| Keywords | 酸化酵素 / CaxE / ジケト構造 / in vitro解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度において申請者は、研究対象である酸化酵素CaxEの機能解析を試みた。具体的には本酵素のin vitroによる酵素反応解析である。つまり、異種発現を行ったCaxEと、有機合成の手法で調製した推定基質を用いた酵素反応により、本酵素が対象化合物の主要骨格であるジケト構造の構築能力を有しているかを精査するためである。これは、過去に対象酵素がジケト構造への変換を行うという報告例が無いことから、本酵素の機能解析を行う上で必須であった。
まず、標的酵素の異種大腸菌による発現を行った。酵素の発現条件を検討するに辺り、種々の発現用プラスミド及びホストの精査を試みた。その結果、大腸菌BLR株において、シャペロンタンパク質過剰発現下でのCaxEの良好な発現を見出した。
続いて酵素反応に用いる基質の有機合成を試みた。生合成機構から推測される、CaxEの基質となり得るポリケタイド／ポリペプチド複合体の有機合成を行った。また、標品として用いる為に、CaxEの推定生合成産物であるジケト化合物も同様に有機合成により調製した。
最後に、酵素CaxEと推定基質による酵素反応を試みた。反応液には酵素及び基質の他に、補酵素であるフラビン化合物及び電子供与体を投与した。酵素反応終結後に、その上清をHPLCにて解析を試みた。その結果、酵素反応特異的な化合物を見出した。本化合物は、別に有機合成により調製した推定生合成化合物と、HPLCによる保持時間が一致した。この事よりCaxEがジケト構造の構築能力を有する事を示すことができた。
本研究は天然物の骨格の多様性を生み出すジケト構造を構築する酵素の具体的な解析を行った数少ない報告例である。なお、本研究は国際学会を含めた複数の学会で発表済みである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究実績の概要に述べたとおりに本研究で対象としている酸化酵素CaxEの機能解析を行い、in vitroにより本酵素がジケト構造の構築能を有する事を示すことができた。これは提出した研究実施計画に則ったものである。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究実績に示したCaxEに対して、引き続き機能解析を続けることとしている。具体的にはCaxEのX線結晶構造解析である。つまり、in vitroによる酵素反応では、本酵素がジケト構造の構築を担っていることを示す事ができたものの、その詳細な反応機構を示すには至っていない。X線結晶構造解析はタンパク質の構造情報を得る手法の１つであり、CaxEの結晶に対してX線を照射し、種々の解析を行うことでその立体情報を獲得する。本解析によりCaxEが活性を有する場所である活性中心を見出すことができる。また、本酵素と基質及び酵素反応産物との複合体構造を獲得することにより、より詳細な反応機構の提唱を行うことが可能であると考えている。複合体構造はCaxEの結晶に基質を添加した後に、X線を照射し、種々の解析を試みることで決定する。
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