2015 Fiscal Year Annual Research Report
エピジェネティックに制御するヒストン修飾酵素複合体ＳＡＧＡとＳＬＩＫの機能的分離
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15J12519
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| Research Institution | University of Fukui |
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Principal Investigator |
釜田 和馬 福井大学, 工学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2017-03-31
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| Keywords | SAGA 複合体 / SLIK 複合体 / エピジェネティクス / RNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
出芽酵母にはヒストン修飾酵素複合体 SAGA (Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase) とその類似複合体 SLIK (SAGA-like) が存在している。この２つの複合体の構造的相違は報告されているものの、機能的相違に関する報告は未だに少ないのが現状である。従って、本研究は、SAGA 複合体とSLIK複合体を機能的に区別するシステムを構築し、これまでに報告されていない環境変化に対する２つの複合体の使い分けを明らかにすること、また、外的ストレスや生育環境の変化、酵母年齢によってどのタイミングで SLIK 複合体による発現調節にシフトするかを単一細胞追跡システムによって明らかにすることを目的として研究を進めている。
SAGA 複合体と SLIK 複合体の機能的分離のためにまず SLIK 依存遺伝子の探索を行った。マイクロアレイ解析により SLIK 複合体依存遺伝子のスクリーニングを行った。スクリーニングの結果、7遺伝子に絞り、さらに解析を行った結果、1つの遺伝子を SLIK 複合体依存遺伝子として解析を進めた。
次に SLIK 複合体解析のために RNA 可視化システムの構築を進めた。これは Kubota T., et al. (2010) に基づいて行っている。この方法は特定の配列に相互作用し蛍光を発する励起子ハイブリダイゼーション感受性オリゴヌクレオチド (ECHO) プローブを用いており、相補鎖に結合した時にのみ蛍光を発し、相補鎖がない場合は蛍光を発することが無い様に設計されている。本研究では、コントロール遺伝子のプロモーターと、SLIK 複合体依存遺伝子のプロモーターそれぞれから2種類の ECHO プローブ相同配列を同時に転写する酵母株と、さらに SLIK 複合体の影響を調べるため SLIK 複合体因子の破壊株も作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
研究計画に従い、下記２つのプロジェクトを行った。
(1)SAGA、SLIK 複合体の区別法の構築
SAGA、SLIK 複合体特異的な構成因子の破壊株を用い、マイクロアレイ解析を行い、様々な条件で絞り込みを行うことにより、最終的に7個の候補遺伝子まで絞り込むことに成功した。更に、変異株を作製し、SLIK複合体依存的な遺伝子１つを同定した。予定より早く遺伝子の絞り込みに成功したため、今後はより詳細に解析を進めていく。
(2)RNA 可視化システムの構築
SLIK 遺伝子の解析を行うためRNA 可視化システムの構築を目指した。今年度は、実験に使用する株の作製を行った。計画通りに構築できたため、今後は作製した株を用い、解析を進めていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、私は SLIK 複合体依存遺伝子は合成最少培地の高濁度条件においてのみ転写量が上昇することを確認できている状態である。従って今後、SLIK 複合体依存遺伝子が活性化する条件を栄養飢餓、熱処理、薬剤処理 等によって SLIK 複合体依存遺伝子が活性化する条件の探索を行う。また、SLIK 依存遺伝子が転写誘導される場合に SLIK 複合体がプロモーターに局在するかを ChIP をによって解析する。活性化する条件を決定した後、蛍光顕微鏡を用いた RNA 可視化による解析を行う。専用のプレートに培地を流し込みながら蛍光顕微鏡によって、単一細胞が増殖していく過程で、完全培地環境から活性化条件に移行した時の SLIK 複合体依存遺伝子の転写量変化の様子をタイムラプスで蛍光観察する予定である。また、破壊株を用いることで活性化のタイミングに違いが生じるか、酵母の老化によって転写量が変化するか、細胞周期で転写量に違いはあるかを検証する。
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