2017 Fiscal Year Annual Research Report
イネ澱粉生合成関連酵素の酵素間相互作用に着目した澱粉構造制御機構の解明
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15J40176
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| Research Institution | Akita Prefectural University |
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Principal Investigator |
クロフツ 尚子 秋田県立大学, 生物資源科学部, 特別研究員(RPD)
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| Project Period (FY) |
2015-04-24 – 2019-03-31
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| Keywords | イネ / 澱粉 / アミロペクチン / 酵素間相互作用 / 複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
イネ胚乳アミロペクチンを伸長する主要なSSアイソザイム（SSI, SSIIa, SSIIIa）の活性が極限まで低下したイネ変異体（ss1L/ss2aL/ss3a）およびその親系統であるss1L/ss2aL/SS3aとSSI/ss2aL/ss3aを用いて、可用性タンパク質を分子量ごとに分画し、酵素間相互作用の変化を明らかにした。溶出画分を変性ゲルで分離後に、ウエスタンブロットを行い、イネの登熟胚乳で高い発現量を示した澱粉生合成関連アイソザイム（SSI, SSIIa, SSIIIa, SSIVb, BEI, BEIIa, BEIIb, PUL, Pho1）のタンパク質複合体の溶出分子量を調べた。その結果、SSI, SSIIa, SSIIIaのいずれのSSアイソザイムの活性が欠損または低下しても、BEおよびDBEの溶出パターンは野生型と大きな違いが無いことが分かった。一方で、他のSSアイソザイムは野生型とは異なる溶出パターンを示し、互いに相補していることが推察された。
また、今年度は澱粉生合成関連酵素複合体の中心的役割を担うSSIIaの活性検出条件を確立した。これまではSSIIaが低活性型のジャポニカ米を使用していたため、従来のグリコーゲンを基質としたNative-PAGE活性染色法でSSIIa活性が検出できないことは問題ではなかった。しかし、SSIIaが酵素複合体形成において重要な働きをすることが明らかになったため、SSIIa活性を検出する方法を立ち上げることは不可欠であると判断した。プライマーとなる基質・アクリルアミド濃度・電気泳動条件・酵素反応条件を検討した結果、１）トウモロコシのアミロペクチンを基質としたNative-PAGEゲルを、２）氷冷しながら泳動し、３）弱アルカリ性反応液で酵素反応を行うことで、明瞭なSSIIa活性バンドが得られることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
申請当初は野生型のジャポニカ米における、澱粉生合成関連酵素の相互作用の検出のみを計画していた。最初の1-2年間で澱粉生合成に関わる複数の酵素が、活性を維持した状態で、高分子量の複合体を形成していることを明らかにした。予想以上に研究が進んだため、2-3年目は、酵素複合体形成におけるSSアイソザイム間の役割の詳細を明らかにすることができた。得られた結果を、研究計画期間中に論文として発表することができたから。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度は4～6月の3ヶ月しか残っていないが、必要な追試を行い、残りのデータを論文として発表する。
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