2017 Fiscal Year Research-status Report
植物由来化合物ピペロングミンによる活性酸素種代謝異常と腫瘍細胞特異的致死の解析
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15K00537
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
田野 恵三 京都大学, 原子炉実験所, 准教授 (00183468)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
増永 慎一郎 京都大学, 原子炉実験所, 教授 (80238914)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | DNA損傷修復 / 細胞内微細環境 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成29年度は、腫瘍細胞微細環境の一つである低栄養下（無グルコース下）特異的に致死効果を示す２種類のビグアノイド薬剤、メトフォルミンとフェンフォルミンについて、DNA修復に関わる機能に焦点を当てた解析を進めた。特にメトフォルミンは糖尿病治療薬として広く使用されていることから、臨床面からも注目を集めている。ニワトリDT40細胞を用いた系におけるDNA架橋損傷の修復に関わるfanc経路遺伝子群欠損細胞に対し、この薬剤が無グルコース下特異的に強い感受性を示すこと、さらにfanc遺伝子群の中でも特にメトフォルミン感受性を示すfannc, fanclの欠損細胞では、臨床治療濃度以下でもDNA損傷が起こることを染色体断裂の発生頻度から証明した。これらは同年度にPlos Oneに投稿し、受理、発表された。さらに28年度にDT40細胞を用いたグルコース枯渇下解析で、DNA-topoisomerase I-DNA complex修復に携わるtdp1欠損株が、メトフォルミン、フェンフォルミン共にグルコース枯渇下で強い感受性を示すことを見いだした。このことから、致死原因損傷の一つとしてTDP1が修復に関与するDNA-topoisomerase I-DNA complex（topo-DNA complex）の可能性が考えられた。そこで、低グルコース下でメトフォルミン処理した細胞からDNA抽出を行い、抗topoisomerase抗体でtopo-DNA complexの同定を試みたが、少なくともDT40細胞ではその存在を認めることが出来なかった。このことは、topo-DNA complexはメトフォルミン誘発のDNA損傷の可能性が薄いことを暗示している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
２種類のビグアノイド薬剤のうち、メトフォルミンについては解析が平成28年度から順調に進んでいる。臨床利用されている細胞濃度においても、fanc欠損下では細胞死をもたらすことについてニワトリリンパ細胞を用いた系を用いた解析を行い、29年度にPlos Oneに投稿、発表済みとなっている。メトフォルミンの臨床への基礎データへの展開のために、従来のトリリンパ細胞由来のDT40からヒトリンパ細胞TK6への転換を進めた。これまでの相同組み換えによる遺伝子破壊手法から、CRISPR Cas9を用いた遺伝子編集の方向に転換した。トリ細胞での結果を元に、メトフォルミンに特に強い感受性を示すfancc及びfancl 欠損細胞をヒトリンパ細胞TK6を用いて試み、fancc欠損細胞を作成することが出来た。既存のfancd2 欠損細胞を加えてメトフォルミン感受性の解析を進めている。さらにfancl欠損細胞の作成の試みも継続している。メトフォルミンにより無グルコース下で誘発するDNA損傷の同定も進めている。最終的にはヒト細胞を用いた実験系を完成させることで、臨床応用への基礎データを蓄積できればと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述したように、ヒト細胞を用いた実験系への移行を積極的に進めている。29年度からTK6を用いた系を進めているが、ヒト一倍体由来のHAP細胞を用いた系の立ち上げもすすめている。一方、無グルコース下で誘発されるDNA損傷の実体には未だ迫れていない。基礎的な解析技術は取得できているので、30年度中にDNA損傷の候補を上げられればと考えている。
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| Causes of Carryover |
（理由）
DNA損傷を誘発しない相同組み換え特異的阻害効果のある新規ピペロングミン類似化合物の合成を試みてきた。候補は上がりつつあるが、精緻な解析には至っていない。そのモニターベクターによる相同組み換え能の解析及び相同組み換え関連タンパクの抗体を用いた細胞内動態のより精緻な解析に必要な研究費の未使用が生じた。
（使用計画）新規ピペロングミン様活性を持つ新規化合物の合成は連帯研究者の永澤により進めらているが現時点では明確な候補は合成されていない。引き続き合成作業を進める。一方で、28年度にChem. Res. Toxicol.に発表した低酸素毒チラパザミンのように細胞内活性酸素レベルの増加と伴いDNA損傷を誘発するような化合物の検索も進める。29年度にPlos Oneに発表した低グルコース毒のメトフォルミンについて、処理細胞でも細胞内酸化レべルの挙動を検索する。致死や染色体断裂のようなマクロな変化のみならず、修復蛋白の細胞内挙動についても関連蛋白の免疫染色での解析を進める。
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[Journal Article] Selective cytotoxicity of the anti-diabetic drug, metformin, in glucose-deprived chicken DT40 cells2017
Author(s)
Kadoda K, Moriwaki T, Tsuda M, Sasanuma H, Ishiai M, Takata M, Ide H, Masunaga S, Takeda S and Tano K
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Journal Title
PLOS ONE
Volume: 12
Pages: e0185141
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Effect of Tirapazamine, Metformin or Mild Hyperthermia on Recovery from Radiation-Induced Damage in Pimonidazole-Unlabeled Quiescent Tumor Cells2017
Author(s)
Masunaga S, Tano K, Sanada Y, Sakurai Y, Tanaka H, Suzuki M, Kondo N, Watanabe T, Takata T, Maruhashi A and Ono K
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Journal Title
World J. Oncol.
Volume: 8
Pages: 137-146
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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