2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K00541
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
唐田 清伸 名古屋大学, 環境医学研究所, 研究機関研究員 (90345017)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
荻 朋男 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (80508317)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 転写共役型ヌクレオチド除去修復 / RNA polymerase II |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の主要な目的である転写共役型ヌクレオチド除去修復（TC-NER）反応のin vitro再構成系の確立のため、蛍光物質修飾をDNA損傷に見たてたDNAテンプレートの構築を行った。1カ所に蛍光物質修飾を組み入れたDNAプラスミドを構築して、HeLaの抽出液を用いてTC-NER反応の再現を試みたところ蛍光物質の切り出しがみられた。しかしながらHeLa抽出液中のヌクレアーゼ活性が非常に高くて切り出された蛍光物質を含むフラグメントはかなり小さな断片になっていたが、TC-NERのテンプレートとしては機能していると思われる。
またTC-NERに重要で機能が未知のUVSSAの結晶構造解析を目的として、UVSSAタンパク質の精製をおこなった。元々非常に不溶性であるためにUVSSAは精製が困難であったが、これまでに効率よくUVSSAを精製する条件を見出し、結晶化をめざしてUVSSAを精製している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
In vitro転写系・TC-NER反応系の確立に向けて、その転写テンプレートとなる蛍光物質でラベルしたDNAプラスミドを構築した。
またUVSSAタンパク質は非常に不溶性で精製が不可能であったが、結晶構造解析に向けて大量精製出来るようになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
FLAGタグとHisタグを付加したRNAポリメラーゼIIを発現する細胞を入手しているので、この細胞を大量に培養してFLAGとHisを利用したアフィニティー精製によりRNAポリメラーゼIIの精製を行う。精製したRNAポリメラーゼIIを用いてin vitro転写系を再構築し、特に蛍光標識テンプレートにおいてRNAポリメラーゼIIの転写が停止することを確認する。その確認が取れた上で、これまでに精製したTC-NER因子を添加していきTC-NER反応系の再構成を試みる。
またUVSSAタンパク質を高濃度・高純度で精製し、結晶化条件をスクリーニングしてUVSSAの結晶化・X線回折による構造解析を行う。
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