2017 Fiscal Year Research-status Report
リグニン由来C6-C3プラットホーム芳香族化合物の高効率バイオ生産系デザイン
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15K00649
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| Research Institution | Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology |
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Principal Investigator |
大田 ゆかり 国立研究開発法人海洋研究開発機構, 海洋生命理工学研究開発センター, グループリーダー代理 (40399572)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
秦田 勇二 埼玉工業大学, 工学部, 教授 (20399562)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | リグニン / バイオマス利活用 / 海洋性細菌 / グルタチオン転移酵素 / β-O-4結合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、C6-C3構造を基本骨格とし、新規機能性バイオプラスチックにもなる新しいプラットホーム芳香族モノマーを、リグニンからバイオ生産する系をデザインすることを目的としている。
H28年度までの研究により、これに必要な5種の酵素、各々について酵素化学的解析を行った。ここで得られた知見に基づき、スギ、ユーカリから抽出したリグニン（Milled Wood Lignin）を用いて、芳香族モノマーをワンポットで生産することにも成功した。
H29年度には、上述の酵素のうちの1種（グルタチオン転移酵素・GST3）の結晶化および構造解析を試みた。その結果、3.4Å分解能を与える結晶が得られ、初期的な構造決定に成功した。GST3の全体構造は、Nuクラスの既報GSTに類似していたことから、本酵素も同クラスに分類可能と考えられた。
続いて、結晶品質改善による、更なる精密構造の解明を目指して、酵素タンパク質へのアミノ酸変異導入を行った。野生型酵素のパッキングを強化、あるいは積極的に壊すためにデザインした変異型の酵素を13種類作成し、それらの活性を評価したところ、11種の変異型酵素において野生型とほぼ同等の活性を保っていることが分かった。野生型酵素で決定した諸条件を起点として、変異酵素における結晶化条件も改めて精査した。その結果、一部の変異型酵素では新たな結晶を得ることができ、その内のいくつかが野生型酵素とは異なる結晶形を示すことも分かった。酵素活性に必須の立体構造を維持したまま結晶パッキングを変えることが可能であったことから、今後さらに高品質な結晶が得られることが期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H29年度までに予定していた計画に従い、天然物から抽出したリグニンを原料とする芳香族モノマー酵素生産とそれに必要な酵素1種の初期的な構造決定に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
芳香族モノマーを酵素生産に必要な酵素のうちの1種の構造をより精密に明らかにするため、これまでに作成した変異型酵素の結晶化条件の精査と構造解析を行う。得られた構造情報をもとに、更なる変異酵素の作成が必要かどうかを見極め、高品質の結晶へと繋げていく。これらの試行を通じ、GST3の精密構造を明らかにし、反応機構の考察を行う。
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| Causes of Carryover |
H29年度予算には、複数の変異酵素を組換え生産するためのプラスミドコンストラクト構築と塩基配列確認、変異酵素精製費用を計上した。そこでは、プラスミドコンストラクトの一部に構築が困難な配列が含まれることを想定し、人工遺伝子全合成のための予算も予定した。しかし、安価な変異導入法によって首尾良く構築できたため、支出を抑えることが出来た。
H30年度には、より精密な酵素タンパク構造解析に必要な追加のコンストラクト作成、酵素精製や結晶化、成果の論文化に必要な費用として使用する。
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