塩味受容体タンパクをセンサーとした塩味増強物質の探索とその単離・精製及び構造解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K00800
• Research Institution: Chubu University
• Principal Investigator: 塚本 義則 中部大学, 応用生物学部, 教授 (60592079)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 堤内 要 中部大学, 応用生物学部, 教授 (50329851) ; 石田 康行 中部大学, 応用生物学部, 教授 (70273266)
• Project Period (FY): 2015-10-21 – 2018-03-31
• Keywords: 塩味増強 / 塩味受容体遺伝子 / 塩味刺激 / 電気生理学的アッセイ / 卵母細胞 / 遺伝子インジェクション / イオンチャネル

Outline of Annual Research Achievements

1.塩味受容体遺伝子(ENaC)発現の安定化条件の設定
塩味修飾アッセイに用いる卵母細胞の塩味受容体インジェクション後からアッセイまでの遺伝子発現条件と卵母細胞の状態について塩味受容体阻害因子であるZn++（50，100，200μM）とアミロライド（10，20，40，60μM）についてその濃度とENaC遺伝子発現との関係を調べた結果、 Zn++では唯一50μMにおいてのみ塩味刺激応答と卵母細胞が安定していたが、アミロライドでは10,20μMでは卵母細胞は安定していたものの塩味刺激の応答が鈍化し、60μMでは塩味刺激応答、卵母細胞の状態ともに良好であったが、60μMでは塩味刺激応答は良好だったものの卵母細胞の状態が著しく異常を示した。これらの結果から、アミロライド40μMで塩味受容体遺伝子のインジェクション後の卵母細胞を培養することに決めた。
2.自然界からの塩味増強物質のスクリーニング
10種類の野菜抽出・透析液からの塩味増強物質のスクリーニングを行った結果、シシトウガラシとブロッコリーで明らかな塩味増強効果が確認された。一方、人参とリンゴで強い塩味抑制効果及びパプリカで弱い塩味抑制効果が認められた。
当初塩味刺激に対して増強効果を示したシシトウガラシとブロッコリーの抽出・透析液のpHを確認したところ、pH6.8と弱酸性を示したことから、改めてpH7.4に調整した後、塩味刺激に対する応用を確認したところ塩味増強のシグナルが認められなかったことから、pHの酸性化による電気信号の発生が生じた可能性が想定されたが、一方、サンプルを含まないpH6.8とpH7.4での塩味刺激に対する応用を比較してもpH6.8で特段電気信号が発生することがなかったことから塩味増強成分が保存中に何らかの作用で失活した可能性も含めて現在サンプル調製段階から再現試験を実施して確認中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1.塩味修飾の安定的なアッセイ系の確確立
本研究課題を推進していく上で最も大きな課題であった塩味受容体遺伝子ENaCのアフリカツメガエルの卵母細胞での安定した遺伝子発現の条件の確立が律速になると想定されたが、安定化因子のZn2+とアミロライドの条件検討の結果、予想外に安定的にENaC遺伝子の発現が可能になった点が大きく寄与している。
2.自然界からの塩味増強物質のスクリーニング
安定的なアッセイ系が確立されたとして次に大きな課題と想定された塩味増強物質のスクリーニングの可能性も予想外に早くスクリーニングできたと考えられる結果が得られたことも大きく寄与している。

Strategy for Future Research Activity

1.自然界からの塩味増強物質のスクリーニングの継続
現在までにシシトウガラシとブロッコリーという2つの有力候補素材が見出されているが、引き続き野菜、果物およぞその他の食品素材を対象に塩味増強物質候補をスクリーニングしていく。
2.塩味増強物質の構造解析の推進
シシトウガラシとブッロリーの2つについては、分子量が3,500以上と推定されることから、セファロールを担体としたゲルろ過で分画を行った後、カラムクロマトグラフィを駆使して有効成分と想定されるものを分離・精製してLC/MS, GC/MSなどの機器分析にかけて構造解析する。この構造解析においてはその専門研究者2名との共同研究を始動させることで効率的かつ効果的に推進していく予定である。
3.塩味増強物質の特許出願
塩味増強物質が分離・精製できかつ構造解析により物質が特定できた場合には大学の知的財産部門の協力を得て特許出願を強力に推進していく予定である。

Causes of Carryover

1.塩味増強物質のスクリーニングの物品費
当初想定した以上に早い段階で塩味増強物質の候補と推定される素材を見出すことができたことから当初計画していたスクリーニングのための物品費の支出が計画以下に下回ったのが大きな理由である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

1塩味増強物質のスクリーニングの再開にともなう物品費
現在までに得られた塩味増強物質候補に加えて当初の計画通りに更なる協力な塩味増強物質の発見のためのスクリーニングに伴う物品費に使用していく計画である。