新規卵白アレルゲンL-PGDSの高感度定量法の開発と低アレルゲン化

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K00833
• Research Institution: University of Kochi
• Principal Investigator: 鈴木 麻希子 高知県立大学, 健康栄養学部, 准教授 (60437001)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 守 高知県立大学, 健康栄養学部, 助教 (00612350) ; 沼田 聡 高知県立大学, 健康栄養学部, 助教 (10565857)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ICT EIA法 / rL-PGDS / 卵白アレルゲン

Outline of Annual Research Achievements

昨年度までに卵白アレルゲンであるLipocalin-type prostaglandin D synthase（L-PGDS）に対する4種のモノクローナル抗体（5E、3B、2A、12F）のうち、高感度な免疫複合体転移測定法 (ICT EIA法) に用いることが可能な抗体5E、3Bの大量調製を行い、ガラクトシダーゼで標識した抗L-PGDS Fab' (5E)-Gal、DNP化とビオチン化を行った抗L-PGDS Fab' (3B)-DNP-Bioを得たことを報告した。今年度は、抗L-PGDS Fab' (5E)-Gal, 抗L-PGDS Fab' (3B)-DNP-Bio, リコンビナント (rL-PGDS) を用いて、ICT EIA法の確立を行った。従来法との比較のため、同ロットのrL-PGDSを用いてELISA法の感度も測定した。その際、96穴プレートはCORNING Costar 9018に変更した。従来法の感度は、96穴プレートを変更したため、既報よりも感度は高くなり、20 ng/ml～100 ng/mlとなった。一方、ICT EIA法の感度は0.01 ng/ml～10 ng/mlと高く、ELISA法の2000倍であり、その変動係数は11.05％であった。卵白中のL-PGDSの測定には、卵白たんぱく質粗抽出液を用いたが、ELISA法、ICT EIA法ともに濃度依存的な値を示さなかった。そこで、硫安沈殿による分画を行ったが、70％飽和硫安では上清にもL-PGDSが残ったため、90%飽和硫安沈殿の画分を用いて、同様の検討を行った。しかしながら、ELISA法、ICT EIA法ともに濃度依存的な測定ができず、何らかの競合物質が存在していることが示唆された。
現在、競合物質についての解析を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ELISA法、ICT EIA法ともに卵白中の何らかの成分により反応阻害が観られた。硫安沈殿後に透析を行っても、その阻害は、やや軽減された程度であった。したがって、阻害物質は、たんぱく質である可能性が高いと考え、現在、native PAGE/SDS-PAGEの二次元電気泳動後に抗L-PGDS抗体を用いたウエスタンブロットを行って、L-PGDSと結合するたんぱく質の同定を進めている。

Strategy for Future Research Activity

現在、native PAGE/SDS-PAGEの二次元電気泳動後に抗L-PGDS抗体を用いたウエスタンブロットを行って、L-PGDSと結合するたんぱく質の同定を進めている。阻害物質がたんぱく質の場合は、等電点沈殿など、L-PGDSと当該たんぱく質の性質の違いを利用して、分離を試み、測定を行う。阻害物質がL-PGDSと結合するのではなく、抗体と結合する可能性も考えられるが、SDS-PAGE/ウエスタンブロットの結果から、変性条件下では、我々が作製したL-PGDSに対するモノクローナル抗体は、特異的に結合することが明らかとなっている。したがって、卵白たんぱく質を変性させた後に、透析を行い、その後、測定する方法等を考えている。阻害物質がたんぱく質でない場合も考えられるが、かつて、L-PGDSを精製した際の条件から、還元剤を用いるなど、阻害物質の影響を受けずに測定する方法について検討し、卵白たんぱく質のL-PGDSを測定するための、サンプルの前処理方法を確立する。その後、本法を用いて、鶏卵白中L-PGDS量の測定を行う。鶏卵は産卵直後のものが必要となるため、県の畜産試験場や養鶏場から購入する。鶏卵種による違いや、保存温度や保存期間による鶏卵中L-PGDS量の変化を明らかにする。L-PGDSは、睡眠や痛みなどに関与し、脳や生殖器などに多く発現することが知られていることから、L-PGDS含量の低いものと高いものとで鶏の系統や飼育状況等の関連性を明らかにし、L-PGDS含量の少ない鶏卵の開発へと繋げる。保存温度や鶏卵の局在（濃厚卵白、水様卵白、胚盤、卵黄など）によってL-PGDS量に明らかな差が認められれば、その部分を取り除く簡便な方法の検討を行い、残りの部分のみを使用した離乳食の検討も行う。

Causes of Carryover

やや研究が計画より遅れていることにより、残額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

H28年度の残額を用いて、L-PGDSの測定系を阻害している卵白中の物質を明らかにし、卵白たんぱく質の前処理方法を確立する。H29年度分については、鶏卵の保存条件によるL-PGDSの変化や、鶏卵種による違いを明らかにし、L-PGDS含量の少ない鶏卵の開発へと繋げる費用に充てる。保存温度や鶏卵の局在（濃厚卵白、水様卵白、胚盤、卵黄など）によってL-PGDS量に明らかな差が認められれば、その部分を取り除く簡便な方法の検討を行い、残りの部分のみを使用した離乳食の検討も行う。