光線力学的酸化処置による抗がん剤耐性獲得細胞の耐性低減化に関する研究

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K01296
• Research Institution: Saitama Medical University
• Principal Investigator: 宮本 裕一 埼玉医科大学, 保健医療学部, 准教授 (00313718)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 生体制御・治療 / 光線力学療法

Outline of Annual Research Achievements

本年度は主として以下の三項目に関する実験検討を行った。
(1)抗がん剤耐性獲得細胞の確立：シスプラチン(CDDP)及びパクリタキセル(TXL)に対して耐性を有するHeLa細胞を、それぞれの抗がん剤の濃度を段階的に上昇させるTakaraらの方法にしたがって確立した。その結果、CDDP耐性獲得HeLa細胞(HeLa/CDDP)のIC50値は、通常培養されたHeLa細胞のそれの2倍以上の濃度を、TXL耐性獲得HeLa細胞(HeLa/TXL)のIC50値は、10倍以上の濃度を示し、Takaraらの確立した耐性獲得HeLa細胞と同等の耐性を有することが確認できた。
(2)励起レーザ光照射システムの構築とPDT諸条件の決定：初年度の設備備品費として計上したPDT用励起ダイオードレーザを6月に購入、既存の定盤付実験台に据付、光軸調整等を行い、波長634-7 nm 及び照射パワー密度 5-50mW/cm2 の範囲内において、一様な光分布を実現できる照射系を構築することができた。また上記細胞群に著しい細胞死を誘導し得ないPDT条件を検討した結果、照射量3J/cm2以下が適切であった。
(3)フローサイトメトリーによるP-glycoprotein(P-gp)を指標としたPDTの影響評価：これまでの実験検討結果より、PDTによるHeLa/TXL細胞の耐性低減効果は、P-gpの薬剤排出能の抑制によって得られることが示唆されている。PDTによる低減化の作用は、酸化傷害等、P-gpの構造に直接的に影響を与えたものであるのか、あるいは支持体である細胞膜に影響を与えた結果であるのかどうかを、P-gpの蛍光抗体を用い、フローサイトメトリによって評価した。その結果、PDTによるP-gpの構造変化を伴う直接的な酸化傷害によって引き起こされたものとは考えにくく、細胞膜の酸化傷害が一つの要因である可能性が考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

実験検討に不可欠である各種抗がん剤耐性細胞を、ほぼ既存の報告と同等の耐性レベルで確立でき、またPDTの励起レーザ光照射システムを構築することができた。来年度より本格的な検証実験が開始されることを考えれば、今年度の主たる目的は達成できたものと考えるが、それに加え、PDTによるHeLa/TXL細胞の耐性低減メカニズムの本質であるP-gpの今後の取り扱いの指針となるデータが得られていることから、現段階において本研究はおおむね順調に推移しているものと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

今年度の研究成果より、PDTによるP-gpの光酸化は、耐性低減に直接的に関与しないことが示唆された。それゆえ次年度以降は、もう一つの仮説であるPDTによる耐性獲得細胞の細胞膜の流動性の低下にPDTによる耐性低減効果の本質があるものと考え、この点に重点を置いた実験検討を行っていく予定である。具体的には脂質酸化蛍光指示薬を用いた蛍光顕微鏡観察とフローサイトメトリーによる脂質酸化物の定量、一分子蛍光イメージングシステムを用い、PDT処置細胞群の細胞膜の分子レベルの挙動を、細胞膜上に分布させたFITC-Dextran分子(分子量70 kDa-1 MDa)の連続モニタを実施、その結果から移動速度を算出、細胞膜の流動性を評価することで、PDTによるP-gpの排出能低下の要因を検討する。