2015 Fiscal Year Research-status Report
核酸医薬品による肝毒性評価手法の構築に向けた基盤研究
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15K01352
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| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
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Principal Investigator |
吉田 徳幸 国立医薬品食品衛生研究所, 遺伝子医薬部, 研究員 (00649387)
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| Project Period (FY) |
2015-10-21 – 2018-03-31
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| Keywords | 核酸医薬品 / 肝毒性 / 相補配列依存的オフターゲット効果 / 自然免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、「核酸医薬品による肝毒性発現の誘導機序を明らかにし、ヒトで肝毒性発現を予測可能な方法論を確立する。」ことである。具体的には、①核酸医薬品によるヒト肝毒性の誘導におけるKey分子を探索する。②Key分子を搭載したレポーター細胞を構築することで、ヒトでの肝毒性発現を予測可能なin vitro評価法を確立する。
現在報告されている核酸医薬品の肝毒性は、核酸医薬品と細胞内蛋白との結合することが主要因と予測されている。しかし、実際には、相補配列依存的オフターゲット効果やToll様受容体（Toll like Receptor; TLR）等を介した自然免疫系の活性化など、最終的には他の様々な要因が重なり発症していると考えられる。そのため、特に肝毒性誘発のきっかけとなるようなKey分子を探索する場合、複合要因となりうる要素をできる限り回避した条件で検証をする必要があると考えられる。実際に、ここまでの肝毒性の研究において使用されているアンチセンスは、製薬企業の核酸医薬品開発でドロップアウトした候補品であり、相補配列依存的オフターゲット効果（経路1）および自然免疫系の活性化（経路2）に起因する毒性が排除されているわけではない。そこで本研究ではまず、細胞内蛋白との結合による毒性に特化した肝毒性評価方法を確立するため、「経路1および2による毒性発現を完全に排除したアンチセンス」を独自に抽出する。平成27年度は、経路1に特化し、申請者らがこれまで整備してきたin silico解析システムを用いて、ヒトおよびマウスのゲノムとヒットしないアンチセンスをコンピュータ内で生成したランダムアンチセンスライブラリから選別した（経路1の排除）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、「相補配列依存的オフターゲット効果を回避したアンチセンスの選別」を実施した。アンチセンス等の短い塩基配列と相補性を有する遺伝子を高速に漏れなく抽出する検索アルゴリズムを利用して、ヒト及びマウスゲノムとヒットしないアンチセンス配列をコンピューター上で作成した。設計した各配列について塩基配列の相同性の検索ツールである「GGGenome」を用いて、ヒト・マウスの全ゲノムを対象としてヒットする領域の数を算出した。設計したアンチセンス配列の塩基長は、近年の核酸医薬品の開発動向も加味し、14塩基長とした。GGGenomeと最適化した抽出プログラムを併用することで、「少なくとも完全相補および1塩基ミスマッチするヒト・マウスmRNAが存在しないアンチセンス」を同定し、この中からさらに「ゲノムとの相同箇所ができるだけ少ないアンチセンス」を抽出した。その結果、①少なくとも完全相補および1塩基ミスマッチするヒト・マウスmRNAが存在せず、かつ、②含有するCG配列が1つ以下であるアンチセンスを数百本同定した。以上の配列を1次候補として、「自然免疫系の活性化による毒性発現」を回避したアンチセンスの選定を進めることとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度においても、「相補配列依存的オフターゲット効果を回避したアンチセンスの選別」を引き続き実施する。抽出したアンチセンスを用いて、「自然免疫系の活性化による毒性発現」を回避したアンチセンスを進める。具体的には、ヒトおよびマウスのTLR9発現細胞を用いて、TLR9の活性化能を持たないアンチセンスを選別する。アンチセンスは1本鎖DNAを主体とした構造であるため、1本鎖DNAを認識するTLR9について評価することが重要と考えられる。以上の解析を進め、「経路1および経路2による毒性発現を完全に排除したアンチセンス」を選別する。次に、抽出した「経路1および経路2による毒性発現を完全に排除したアンチセンス」をマウスに投与し、マウスにおいて肝毒性を誘発する“毒性アンチセンス”と誘発しない“無毒性アンチセンス”に分類する。本研究の目的である「肝毒性の誘導におけるKey分子」の同定を達成するためには、複数本の肝毒性誘発アンチセンスを必要とするため、少なくとも1，2本ではなく数本程度は必要であると考えている。最終年度には、分類した“毒性アンチセンス”と誘発しない“無毒性アンチセンス”を用いて、肝由来細胞あるいはマウス肝臓における遺伝子発現変動を解析することによって、核酸医薬品による肝毒性の要因となるKey分子の同定を進める。
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| Causes of Carryover |
本研究課題の交付内定を頂いたのが年度途中（平成27年10月21日）であったため、研究費執行にあたり次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額については、平成28年度から実施予定である「自然免疫系の活性化による毒性発現」を回避したアンチセンスの選別で用いる試薬類等に使用する予定である。
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