2016 Fiscal Year Research-status Report
骨格筋への多価陽イオン投与による廃用性筋萎縮予防法開発のための基礎的研究
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15K01401
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| Research Institution | Kansai University of Welfare Sciences |
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Principal Investigator |
森 禎章 関西福祉科学大学, 保健医療学部, 教授 (70268192)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山路 純子 (田代純子) 関西福祉科学大学, 健康福祉学部, 准教授 (40340559)
廣島 玲子 関西福祉科学大学, 保健医療学部, 准教授 (40404777)
宮崎 彩子 兵庫医科大学, 医学部, 准教授 (20298772)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 骨格筋 / ミオシン重鎖タイプI / カルシニューリン / IL-6 / イオンチャネル / 多価陽イオン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
廃用性筋萎縮においてはタイプI線維が著明に減少することが報告されており、タイプI線維の収縮蛋白であるミオシン重鎖タイプI（MyHC I）も著明に減少することが知られている。近年ではMyHC Iを増加させる因子としてインターロイキン-6（IL-6）の存在が注目されている。IL-6は免疫細胞より分泌されるサイトカインとして広く知られていたが、運動負荷による低酸素やグルコース欠乏により骨格筋細胞からも分泌され、オートクライン・パラクラインにより骨格筋細胞に作用することで収縮蛋白を増加させ、骨格筋細胞の肥大を生じさせる。骨格筋細胞においてIL-6は、細胞内Ca2+濃度上昇によりCa2+依存性脱リン酸化酵素であるカルシニューリンが活性化された結果、転写因子であるNFATが活性化され、IL-6の産生が増加するものと考えられている。
これまで我々は、カルシニューリン活性化剤であるクロロゲン酸の投与によりIL-6およびMyHC IのmRNA発現量が増加することを見出しているが、TRPチャネルを阻害して細胞内Ca2+濃度を低下させる目的でLa3+を投与すると、IL-6およびMyHC IのmRNA発現量が増加することを見出した。La3+によるこれらのmRNA発現量増加はサイクロスポリンAの同時投与により抑制されるため、細胞内にLa3+が流入した結果カルシニューリンが活性化されることによるものと考えられた。他の多価陽イオンについても検討したところ、Gd3+およびNi2+の投与においても同様の結果を得た。そこで、多価陽イオンの細胞内への流入経路を検討するため、La3+に加えてニフェジピンを同時投与してもLa3+のIL-6およびMyHC Iに対する効果には変化が認められなかった。したがって、L型Ca2+チャネルはLa3+の細胞内への流入には関与していないことが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度は、C2C12細胞を用いた分子生物実験によりLa3+、Gd3+、ならびにNi2+の細胞内への流入経路をチャネル阻害剤を投与することで検討し、さらにパッチ・クランプ実験装置を完成させて基礎実験を行う予定であった。分子生物実験においては概ね順調に推移し、La3+の細胞内への流入経路にL型Ca2+チャネルが関与していないことが明らかとなった。パッチ・クランプ実験においては、昨年度においてパッチ・クランプアンプのインターフェースをUSB仕様に改修し、本年度はパッチ・クランプアンプとコンピューター（Apple社iMac）との接続を行うことで、無事に動作することを確認した。また、パッチ・クランプとノイズ除去装置（Quest Scientific社HumBug）との接続も行い、これを介してデータ記録装置（ADInstruments社PowerLab 2s）よりコンピューター（Apple社MacBook Air）に問題なく記録されることを確認した。したがって、電気的な部分においてはパッチ・クランプ実験装置はほぼ完成を迎えた。
さらに、昨年度に前倒し申請により倒立顕微鏡を購入し、これに設置するマニピュレーター装置の完成を試みたが、既存のマニピュレーターのメインテナンスは完了したため、手持ちのマニピュレーターを新しい顕微鏡に取り付けるためのアダプタの作成を特注にて行った。しかし、新しい顕微鏡に取り付けるアダプタの位置調整に手間取り、一旦作成されたアダプタの改修作業を現在行っている。したがって、パッチ・クランプ実験が開始できていないため、進捗状況としてはやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、早急にパッチ・クランプ実験装置を完成させ、C2C12細胞を用いたパッチ・クランプ法による基礎実験をおこなう。すなわち、マニピュレーター装置の実装および動作確認、浴液灌流装置の設置ならびに動作確認を行った上で、パッチクランプ装置におけるノイズ除去をおこなう。この上でC2C12細胞を用いてギガオームシールを形成し、ギガオームシールの状態でノイズ除去、浴液灌流装置の動作確認、さらにはデータ記録装置の動作確認を行う。
動作確認を行った上で、C2C12細胞を用いたパッチ・クランプ法のホールセル記録法により、La3+電流、Gd3+電流、Ni2+電流の記録をおこなう。C2C12細胞は、2%FCS含有培養液中で3日間分化させたものを実験当日にトリプシン処理により単離し、35 mmディッシュに播種後2時間より実験を開始する。電極内液の組成は2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、120 mM NaCl、10 mM HEPES、11 mM EGTA、4 mM Mg-ATP、細胞外液の組成は2 mM CaCl2、135 mM NMDG-Cl、10 mM HEPES、10 mM Glucoseとし、細胞外液に300 uMのLa3+、Gd3+、もしくはNi2+を添加することで、ホールセル電流の変化を観察する。また、これらの多価陽イオンの投与によりホールセル電流が増加した場合には、Ca2+チャネル阻害剤等を投与し、ホールセル電流の変化を観察する。
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| Causes of Carryover |
本年度においてマニピュレーター取り付けアダプタを特注にて作成し、マニピュレーターを倒立顕微鏡に取り付け、パッチ・クランプ実験装置を完成させる予定であった。しかし、マニピュレーター取り付けアダプタの作成において、取り付けねじ穴の位置調整に時間がかかり、パッチ・クランプ実験装置の完成が遅れた。このため、パッチ・クランプ法を用いた基礎実験を行うことが出来ず、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度において、マニピュレーター取り付けアダプタを早急に完成させ、パッチ・クランプ装置を実験可能状態にする、具体的には、取り付けアダプタを完成させることによるマニピュレーターの倒立顕微鏡への取り付け、溶液灌流装置の取り付け、ノイズ除去などを行い、本年度遂行できなかったパッチ・クランプ法による基礎実験を行う。次年度使用額は、基礎実験ならびにイオンチャネル阻害剤実験を遂行するための試薬・培養液等の費用として割り当てる。
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