2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K01642
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
土持 裕胤 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (60379948)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | muscle afferent / exercise pressor reflex / dorsal root ganglia |
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| Outline of Annual Research Achievements |
TRPV1チャネルアンタゴニストの投与実験により、TRPV1チャネルが筋収縮時の血圧応答に重要である、との先行研究がある。その報告を元に、まずラットにテレメトリー式血圧測定送信機を埋め込み、TRPV1チャネルアンタゴニストであるSB366791 または ルテニウムレッド投与下でトレッドミル運動させた。その結果、投与前後で血圧・心拍応答に差異はなかった。次にTRPV1チャネルの強力なアンタゴニストであるIRTXを投与したところ、運動時の血圧応答は変わらなかったが、心拍応答が著しく減弱した。IRTXにはアゴニスト作用もあるため、TRPV1チャネルアゴニストであるCapsaicinまたはRTX投与下でも同様にラットを走らせた。その結果、やはり心拍応答が減弱していた。次に、全身性ではなく活動筋からの求心性入力のみを操作するため、両側の坐骨神経にTRPV1アゴニストを投与して、トレッドミル走を行わせた。その結果、やはり運動時の心拍応答は明らかに減弱された。TRPV1チャネルをアゴニスト刺激すると、TRPV1発現神経が脱感作状態になることが報告されている。以上の結果から、TRPV1チャネルではなく、TRPV1チャネル発現神経が運動時の反射性心拍調節に関与しており、TRPV1アゴニスト投与はTRPV1発現神経の脱感作を介して心拍数応答を減弱させた、と推察した。おそらくTRPV1発現神経上に発現しているTRPV1チャネル以外の何らかのチャネル／受容体が運動時に活性化されることで反射性に心拍数を調節していると考えた。また、TRPV1発現神経は動的運動時の昇圧応答に対しては重要な役割を果たしていない可能性が示された。現在、坐骨神経のうち、IB4陽性神経の役割を調べるため、IB4陽性神経特異的に除神経が可能なIB4-saporinの坐骨神経内投与を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
動的運動時の神経性循環調節メカニズムに関して、これまで、TRPV1チャネルが運動時の反射性循環調節にどのように関わっているのかについては意見が分かれていた。しかしながら本研究により、先行研究の一部がTRPV1チャネルの阻害とTRPV1チャネル発現神経自体の抑制とを混同していた可能性が出てきた。また、用いるTRPV1チャネル阻害剤の種類が異なる結果を生む原因となっていることも明らかとなりつつある。これらに関して本研究においてすでに解決の糸口が見出され、動的運動時の神経性循環調節においてTRPV1チャネル自体というよりはTRPV1チャネル発現神経が反射性循環調節に重要な役割を果たしているという知見が得られた。TRPV1チャネル刺激によるTRPV1発現神経の脱感作は当初想定していなかったが、本研究の手法として有用であると思われる。
本研究にて行う化学的除神経の組織学的評価に関して、SeeDBやCUBIC,CLARITYといった臓器・組織を透明化する技術と、共焦点レーザー顕微鏡観察技術を組み合わせて脊髄後根神経節を観察したところ、脊髄後根神経節の細胞体を3次元的に観察することが可能であることがわかった。したがって、今後免疫染色技術および遺伝子組み換え動物作製技術と組み合わせることにより、脊髄後根神経節細胞体を2次元だけでなく3次元的に解析可能となり、本研究で用いる化学的除神経法の効果をより詳細に評価することが可能となるかもしれない。
以上のことから、本研究1年目において、これまで混乱していた先行研究結果の不一致を是正する糸口が見つかったこと、並びに、（当初は実験計画に入れていなかった）組織透明化技術および共焦点レーザー顕微鏡・2光子励起顕微鏡観察の組み合わせにより実験結果をより詳細に解析可能になる方法を見出しつつあることから、研究がおおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画段階では初年度に静的筋収縮プロトコル、最終年度に動的運動プロトコルの予定であったが、予備実験的にトレッドミル運動実験を行ったところ良好な結果が得られたため、一部順番を入れ替えて実験を進めている。それ以外は実験計画に沿って行う。まず上述の通り、全身性ではなく活動筋からの求心性入力を操作するため、両側の坐骨神経にTRPV1アゴニスト、およびIB4陽性神経特異的に除神経が可能なIB4-saporinの投与を試みる。さらに、自身の先行研究結果に基づき、NaV1.7、NaV1.8、酸感受性イオンチャネルASIC3特異的ターゲットトキシンを作成し、IB4陽性神経特異的除神経と同様のプロトコールで実験を行う。間欠的な筋収縮刺激と連続的な収縮刺激、および代謝産物の蓄積度合いにより刺激される神経群が異なると考えられることから、トレッドミル運動での評価と並行して静的筋収縮における上記イオンチャネル・受容体の役割の評価を試みる。
本研究は選択的除神経が循環応答をどのように変化させるのかを評価することが目的であるが、今後、そのメカニズムを知るためには運動時の筋からの求心性神経活動が除神経時にどのように変化しているのかを調べる必要がある。つまり、特定のイオンチャネル・受容体を阻害した際に、それが神経活動自体にどのように影響するのかを評価する必要がある。脊髄後根神経から単一神経活動を電気生理学的に計測する技術は有しているが、技術的にとても難しく、実験効率が悪い。そのために、蛍光カルシウムプローブであるGCaMPを脊髄後根神経節神経に発現するマウスを作製し、筋収縮時の神経活動（蛍光強度の変化）を2光子励起顕微鏡にて観察・測定する実験系を構築する必要がある。本研究の予算では実現不可能であるが、将来の実験計画を念頭において、スムーズに研究を発展させていけるよう、本研究を推進していく。
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| Causes of Carryover |
年度末に生じた残高に対し、緊急に必要な使用目的がなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度助成金と合わせて、消耗品の購入に充てる。
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