2015 Fiscal Year Research-status Report
アジアのT2欠損症およびHSD10病の遺伝子変異の同定と遺伝子型、表現型の解析
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15K01693
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| Research Institution | Chubu University |
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Principal Investigator |
青山 友佳 中部大学, 臨床検査技術教育・実習センター, 助教 (40460498)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 先天代謝異常症 / ケトン体代謝 / T2欠損症 / HSD10病 / ACAT1遺伝子 / HSD17B10遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、アジアのT2欠損症とHSD10病の患者の遺伝子解析から遺伝子型および表現型、そして、遺伝子変異の民族間での違いを明らかにし、その情報を発症や症状の予測に役立てることである。今年度においては、日本、インド、ベトナムからのT2欠損症疑い18症例について遺伝子解析を実施した。これら症例の解析ではACAT1遺伝子での変異が同定され、HSD10病を疑う症例はなかった。そのなかで、申請者らはT2欠損症の1症例においてc.121-13T>Aのホモ接合性の新たな変異について詳細な解析を行った。この変異はイントロン2のスプライスアクセプター部位のポリピリミジン領域に存在しており、この領域の変異はスプライシングに影響する可能性が考えられた。まず本症例がT2欠損症であるかを確認するために、先ずT2酵素活性測定およびイムノブロット解析を行った。その結果から、T2の活性は存在せず、またタンパクも検出されなかったことからT2欠損症と同定した。次に、患者線維芽細胞をcycloheximide存在下で培養してmRNAを抽出、cDNA解析を行ったところエクソン3のスキップが明らかになった。さらに、この変異がエクソン3のスキップを引き起こすことを証明するために、c.121-13T>A, T>C, T>Gの変異construct を作製してmini-gene splicing実験を行った。各変異constructの泳動結果では、患者と同じ変異であるT>Aはエクソン3のスキップを生じ、T>Gでも同様であり、T>Cではエクソン3のスキップとわずかに正常なバンドを確認した。また、wild-typeにおいても正常なバンドとエクソン3のスキップを確認した。この配列の位置での変異はスプライスアクセプター部位の認識を弱めることが考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
T2欠損症が疑われた症例への遺伝子解析は順調に解析出来ており、患者背景、検査データ等の調査を目標通り進めている。また、ACAT1遺伝子とHSD17B10遺伝子のいくつかのSNPを明らかにするためのプライマー設定は進行しているが、解析をするまでには至っていない。T2欠損症の1症例においてc.121-13T>Aのホモ接合性の新たな変異について解析を試みた。T2欠損症であるかを明らかにするためのT2酵素活性測定とイムノブロット解析に取り組み、さらに、患者線維芽細胞のcycloheximide存在下での培養後、mRNAを抽出しcDNA解析を行った。この変異がエクソン3のスキップを引き起こすことを証明することは重要であったためc.121-13T>A, T>C, T>Gの各種変異construct を作製してmini-gene splicing実験を優先して行った。本症例は第57回日本先天代謝異常学会にて報告をしており、現在、この遺伝子変異解析について論文化を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度で確立した方法および結果に基づき、さらなる患者の遺伝子解析と症状との関連性の確認に取り組む。
1) T2欠損症とHSD10病の遺伝子型/表現型相関と民族間の遺伝子変異の比較検討として、患者調査とこれまでの遺伝子解析結果および民族間での遺伝子変異の違いを比較する。昨年度に引き続き、タンデムマス、臨床症状や生化学データにてT2欠損症疑いの新たな症例の遺伝子解析を実施する。遺伝子解析にて詳細な解析が必要な場合には、MLPA解析、long range PCR、mini-gene splicing実験等を用いてその変異を明らかにする。
2) ACAT1遺伝子、HSD17B10遺伝子のSNP解析の実施と民族間での比較として、平成27年度に設計したプライマーを用いてSNP解析を実施して民族間での差や共通点を検討する。民族間での遺伝子変異の違い、変異による酵素活性や症状の現れ方の違い等、その関連性について情報をまとめる。
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| Causes of Carryover |
T2欠損症の新たな変異がスプライシングに与える影響を明らかにするために必要なmini-gene splicing実験を優先して行ったのでACAT1遺伝子およびHSD17B10遺伝子におけるSNP解析を行うための消耗品購入費を繰り越した。平成28年度はこの解析に取り組み、その費用と合わせて使用することとした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度の研究費は、主に実験機器や遺伝子解析に必要な試薬などの消耗品に使用する。遺伝子解析の結果から、遺伝子変異を同定するために必要であればMLPA解析およびmini-gene splicing実験も取り入れて研究の発展を目指す。
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[Journal Article] Application of multiplex ligation-dependent probe amplification, and identification of a heterozygous Alu-associated deletion and a uniparental disomy of chromosome 1 in two patients with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase deficiency2015
Author(s)
Aoyama Y, Yamamoto T, Sakaguchi N, Ishige M, Tanaka T, Ichihara T, Ohara K, Kouzan H, Kinosada Y, Fukao T.
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Journal Title
International Journal of Molecular Medicine
Volume: 35
Pages: 1554-1560
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Two patients with atypical form and one with infantile form of HSD10 disease were identified in Japan2015
Author(s)
Fukao T, Sasai H, Aoyama Y, Akiba K, Goto M, Hasegawa Y, Kobayashi M, Ida H, Akagawa S, Hasegawa Y, Yamaguchi S, Shigematsu Y.
Organizer
Annual symposium of the society for the study of inborn erroros of metabolism
Place of Presentation
Lyon (France)
Year and Date
2015-09-01 – 2015-09-04
Int'l Joint Research
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