2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K01715
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
臼井 真一 岡山大学, 保健学研究科, 准教授 (50346417)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
廣畑 聡 岡山大学, 保健学研究科, 教授 (90332791)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | リポ蛋白 / アポリポ蛋白Ｅ / ＨＤＬ / 生活習慣病モデルマウス / 肥満 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は，生活習慣病モデルマウスのリポ蛋白質分析およびアポE含有HDL(アポE-HDL)の精製法を中心に検討を行い，以下の成果を得た。
１．陽イオン交換カラムとヘパリンカラムを直列に連結したタンデムHPLC法により，マウス血清のアポE-HDLコレステロール定量を試みた。しかし，採血の際に生じた溶血やヒトとマウスにおけるリポ蛋白粒子組成の違いなどがアポE-HDLの測定値に影響を及ぼしている可能性が浮上した。このため，ポリエチレングリコールで分離したHDLを陽イオン交換カラムで分離・定量する方法を新たに検討した。その結果，db/dbマウス（10週齢）は野生型マウス(C57BL/6)に比べ総HDL-コレステロールは高値であったが，予想に反してアポE-HDL-コレステロールには有意差が認められなかった。一方，ob/obマウス（10週齢）は野生型マウスやdb/dbマウス，高脂肪食負荷肥満モデルマウスよりもアポE-HDL-コレステロールが高値であることが確認できた。ob/obマウスとdb/dbマウスでは体重に有意差がなく，血清グルコース濃度や肝臓重量がob/obマウスで高値傾向であった。
2. 健常人血清から細胞培養実験に用いるアポE-HDLの精製を行った。既報に従いヘパリンカラムを用いて精製を試みたが，この方法ではアポE-HDLだけでなく，アポEを含まない他のHDLも一部混入している可能性が示唆された。分析条件を検討した結果，特に緩衝液中のMg濃度が分離に影響することが明らかとなった。このため分離に用いるカラムを陽イオン交換カラムに切り替え，適切なMg濃度で分析することにより改善された。精製したHDLはHDLに含まれるアポA-IとアポEに対する抗体を用いたサンドイッチELISAで検出できたことから，精製HDLは同一粒子内にアポA-IとアポEを含んでいることが確認できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
動物実験管理委員会および倫理委員会による承認が予想よりも時間を要したため，実験開始時期が遅れた。また，血清を提供してくださる健常人ボランティアの集まりが予定よりも少なく，アポE-HDLの精製条件の設定に時間を要している。このため，本年度実施を予定していた細胞培養条件等に関する予備実験を行わなかったため，やや予定より遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に引き続き，研究計画書に沿って実験を進めていく予定である。アポE-HDLの分離精製が予定よりも少し遅れているが，準備でき次第，培養脂肪細胞を用いてアポE-HDLの抗肥満作用やグルコース取り込み能への影響を調べていく。また，これまでの実験結果では，db/dbよりもob/obマウスの方が著しくアポE-HDLが増加しており，肝臓でのHDL代謝がアポE-HDLの血清濃度に関与する可能性が示唆されたことから，肝臓におけるアポ蛋白等のmRNA発現を調べ，血清アポE-HDL濃度との関連を検討することを考えている。
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| Causes of Carryover |
アポE-HDLの精製が予定よりも遅れているため，本年度実施を予定していた細胞培養条件等に関する予備実験を実施しなかった。このため，培養関連試薬等の消耗品の購入が生じなかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H28年度は細胞培養実験を中心に研究を実施する予定であるため，H27年度の未使用額は培養関連試薬等の購入にあてる。H28年度分の助成金は，培養細胞関連試薬，リポ蛋白精製・分析用試薬，RNA抽出・分析用試薬，プラスチック消耗品，研究成果発表の旅費等に使用する。
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[Presentation] Hepatic triglyceride lipase is mainly located on apoE-rich HDＬ in post-heparin plasma2015
Author(s)
Usui S, Shinohata R, Nakajima K, Miyashita K, Imamura S, Sato K, Okajima F, Kobayashi J, Shirakawa T, Shimomura Y, Machida T, Sumino H, Murakami M
Organizer
2015 American Association for Clinical Chemistry Annual Meeting
Place of Presentation
Ａｔｌａｎｔａ（Ａｍｅｒｉｃａ）
Year and Date
2015-07-29
Int'l Joint Research
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