2015 Fiscal Year Research-status Report
糖尿病性骨代謝異常における分子制御機構の解明とその治療戦略の構築
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15K01725
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
高橋 和人 杏林大学, 医学部, 助教 (80508292)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石田 均 杏林大学, 医学部, 教授 (80212893)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 骨芽細胞 / VEGF / 温熱処理 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.糖尿病性骨代謝異常の本態は骨吸収亢進と考えられているが、2型糖尿病では破骨細胞活性化に関与するRANKL関連シグナルを抑制するRANKLのデコイ受容体OPGが増大するため、RANKL以外の破骨細胞活性化因子の存在が推測された。我々は、破骨細胞分化促進・活性化因子のVEGFが高脂血症下で増大し、破骨細胞活性化による骨吸収を亢進させ糖尿病性骨代謝異常を発症させる可能性を見出した。
2.破骨細胞由来の主要なサイトカインTNF-α,IL-1βでUMR106骨芽細胞を刺激した結果、TNF-αでMCP-1（VEGF以外の主要な破骨細胞分化促進・活性化因子）の分泌が、IL-1βでVEGF120が増大した。ただしTNF-αでMCP-1 mRNA発現が増大するが、IL-1βでVEGF120を含むVEGF-A mRNAは増大しなかった。この結果より、高脂血症下で活性化した破骨細胞からTNF-α,IL-1β分泌され、これらが骨芽細胞からMCP-1,VEGF120分泌を増強し、さらに破骨細胞が分化・活性化される悪循環が糖尿病性骨代謝異常の基盤病態と推察された。さらに、これらサイトカインの制御機構は相違していると考えられた。
3.インスリン抵抗性を改善させると報告された41℃20分間の短期温熱処理で、TNF-α,IL-1βでUNR106細胞から増大したMCP-1,VEGF120分泌が減弱した。この結果は、温浴などの温熱加療が糖尿病性骨代謝異常の効果的な治療法となることを初めて実証した重要な結果である。
4.温熱処理によるインスリン抵抗性改善作用の主幹であるHSP72発現は温熱処理UNR106細胞で上昇するが、温熱処理にTNF-α,IL-1β刺激に加えても変化しなかった。従って、温熱処理によるTNF-α,IL-1β刺激性MCP-1,VEGF120分泌の減弱に対するHSP72の影響は微弱と考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
血糖変動状態下でUNR106骨芽細胞からのVEGF120分泌は変化しなかった。また、UNR106をパルミチン酸処理しVEGF120分泌に関与する因子を予備的ではあるが網羅的に解析した結果、細胞ストレスは上昇せずTLR4以外の細胞表面レセプターも検出できなかった。さらに細胞内シグナル伝達経路はPI3K経路以外認めず転写因子も同定できなかった。特にシグナル伝達経路に関しては、パルミチン酸誘導性VEGF120分泌増大への関与の有無によらずPI3K経路以外に有意に変化するものを実証できなかった。
従って、これらのさらなる詳細な解析及びパルミチン酸刺激下で増大するVEGF120以外の破骨細胞活性化因子の同定は困難と予想されたため、計画を変更しVEGF120以外の破骨細胞活性化因子の同定のため活性化破骨細胞において増強すると報告されたTNF-α,IL-1βでUNR106を刺激し、分泌が増大する因子の特定を遂行した。
結果、IL-1βでVEGF120分泌が増大したがVEGF120を含むVEGF-A mRNAは増大しなかった。一方、TNF-αでMCP-1（最近確認されたVEGF以外の主要な破骨細胞活性化因子）分泌とmRNA発現が増大した。
よって、高脂血症下で活性化した破骨細胞からTNF-α,IL-1β分泌され、これらが骨芽細胞からMCP-1,VEGF120分泌を増強し、破骨細胞がさらに分化・活性化される悪循環が糖尿病性骨代謝異常の基盤病態と推察されたが、これらサイトカインの制御機構は相違しているとも考えられた。
加えて、温熱処理の影響も検討した。温熱処理は、パルミチン酸刺激性VEGF120分泌の増大にはほぼ影響しなかったが、TNF-α,IL-1β刺激によるMCP-1,VEGF120分泌の増強は有意に減弱させた。よって、温熱加療が糖尿病性骨代謝異常進展を抑制する治療法となりえることが実証された。
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| Strategy for Future Research Activity |
我々は研究計画の変更を余儀なくされたが、逆にこれにより糖尿病性骨代謝異常進展の基盤病態を解明することができた。従って今後はこの結果をさらに詳細に解析していくことを最重要課題とする。TNF-α,IL-1β刺激でUNR106細胞から増大するMCP-1,VEGF120分泌は41℃20分間の短期温熱処理で減弱したが、さらに温熱処理がこれらの細胞内タンパクとmRNAレベルに対する影響を検討する。また、温熱処理の効果がHSP72介在性であるかに関しては、HSP72のsiRNAを使用したRNAiを導入し、TNF-α,IL-1βで増大するMCP-1,VEGF120分泌の温熱処理による変化を解析し重ねて評価する。さらに、TNF-α,IL-1β刺激性MCP-1,VEGF120分泌増大の温熱処理による減弱に関連する細胞内シグナル伝達経路、責任転写因子も同定する。さらに、温熱処理が転写後調節の段階で作用していることが確認された場合は、microRNAなどの関与を次世代シークエンサーを含めた手法により解析する。そして、温熱処理以外に検討予定であったmitochondrial uncouplingとIL-10が、パルミチン酸刺激性VEGF120分泌の増大、ならびにTNF-α,IL-1βでのMCP-1,VEGF120分泌の増大に与える影響も検討する。
次に、パルミチン酸刺激、血糖変動状態下でUNR106細胞において発現が増大する分泌因子を次世代シークエンサーを使用したRNA-seq法で絞り込み、そしてそれらの破骨細胞活性化レベルを評価することでVEGF120以外の破骨細胞活性化因子同定する（パルミチン酸刺激ではVEGF120以外の破骨細胞活性化因子の存在は可能性が低いと考えられるため、血糖変動状態下での解析を優先的に行う）。さらに、同定された因子に関してはMCP-1,VEGF120と同様の解析を遂行する。
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| Causes of Carryover |
当初の計画通り実験を遂行したが、血糖変動状態下でVEGF120分泌は変化しなかった。また、VEGF120分泌に関与する因子を予備的であるが網羅的に解析した結果、細胞ストレス、TLR4以外の細胞表面レセプター、PI3K経路以外の細胞内シグナル伝達経路の関与は認めず、転写因子も同定できなかった。特にシグナル伝達経路はVEGF120への関与にかかわらずPI3K経路以外に実証できなかった。従って、さらなる詳細な解析及びパルミチン酸で増大するVEGF120以外の破骨細胞活性化因子の同定は困難と予想されたため計画を変更し、VEGF120以外の破骨細胞活性化因子の同定のため活性化破骨細胞において増強すると報告されたTNF-α,IL-1βでUNR106を刺激し、分泌が増大する因子の特定を遂行した。これにより、本年度に行う予定であった実験費用のかかる実験の多くを遂行しなかったため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
TNF-α,IL-1βでUNR106から増大するMCP-1,VEGF120分泌は41℃20分間の温熱処理で減弱したが、これらの細胞内蛋白とmRNAレベルに対する影響も検討する。またHSP72のRNAiにより、TNF-α,IL-1βで増大するMCP-1,VEGF120分泌の温熱処理での変化を解析しHSP72介在性であるかを評価する。さらにこの温熱処理が関与する細胞内シグナル伝達経路、責任転写因子も同定する。加えて、温熱処理が転写後調節の段階で作用していることが確認された場合は、microRNAなどの関与を次世代シークエンサーを含めた手法により解析する。そして、温熱処理以外に検討予定であったmitochondrial uncouplingとIL-10が、パルミチン酸刺激性VEGF120分泌の増大、及びTNF-α,IL-1βでのMCP-1,VEGF120分泌の増大に与える影響も検討する。
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