2017 Fiscal Year Research-status Report
糖尿病性骨代謝異常における分子制御機構の解明とその治療戦略の構築
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15K01725
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| Research Institution | Kyorin University |
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Principal Investigator |
高橋 和人 杏林大学, 医学部, 助教 (80508292)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石田 均 杏林大学, 医学部, 教授 (80212893)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 糖尿病骨代謝異常 / 温熱処理 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1.主要な破骨細胞由来因子であるTNF-α,IL-1βでUMR106骨芽細胞を刺激した結果、TNF-αでVEGF以外の主要な破骨細胞分化・活性化因子であるMCP-1分泌が、IL-1βでVEGF120(完全分泌型VEGF)の分泌が増大した。ただしTNF-αでMCP-1mRNAが増大したが、IL-1βでVEGF120を含むVEGF-AのmRNAは増大しなかった。従って、高脂血症下で分化・活性化した破骨細胞由来のTNF-α,IL-1βで、骨芽細胞からのMCP-1,VEGF120分泌が増大し、これがさらに破骨細胞の分化・活性化を増強させる悪循環が糖尿病骨代謝異常の基盤病態と推察され、またこれらの分泌制御機構は相違していると考えられた。
2.41℃20分間の短期温熱処理で、TNF-α,IL-1βで増大したMCP-1,VEGF120分泌及び細胞内含量が有意に減弱したが、mRNAレベルには有意な変化は生じなかった。この結果は、温熱処理が糖尿病骨代謝異常の効果的な治療法となることを初めて実証した重要な知見であり、加えて温熱処理が転写後調節の段階でこれら因子の分泌を負に制御していることも推察された。
3.温熱処理で増大し、多様な作用が報告されているHSP72のsiRNAを使用したRNAi実験において、HSP72のノックダウン下においても、温熱処理はTNF-α,IL-1βで増大したMCP-1,VEGF120分泌を有意に減弱させた。従って温熱処理によるTNF-α,IL-1β刺激性MCP-1,VEGF120分泌の減弱にはHSP72の影響は微弱と考えられた。
4. 全般的翻訳抑制に関与するeIF2αのリン酸化は、温熱処理、TNF-α,IL-1βによっては有意な変化が生じなかった。よって温熱処理によるTNF-α,IL-1β刺激性MCP-1,VEGF120分泌の減弱にはeIF2αの関与は否定的であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
我々は、上記のように現在まで主要な破骨細胞由来因子であるTNF-α,IL-1βでUMR106骨芽細胞を刺激した結果、TNF-αでMCP-1分泌が、IL-1βでVEGF120(完全分泌型VEGF)の分泌が増大し、またTNF-αでMCP-1mRNAが増大したが、IL-1βでVEGF120を含むVEGF-AのmRNAは増大しなかったことを確認した。さらに41℃20分間の短期温熱処理で、TNF-α,IL-1βで増大したMCP-1,VEGF120分泌及び細胞内含量が有意に減弱したが、mRNAレベルには有意な変化は生じなかったことも確認した。加えて、HSP72のsiRNAを使用したHSP72のノックダウン下においても、温熱処理はTNF-α,IL-1βで増大したMCP-1,VEGF120分泌を有意に減弱させることも見出した。
しかしながら、昨年度は職場環境における業務の負荷の増大など、研究以外の業務の増大のため、実験の遂行がかなり困難となり、その結果、全般的翻訳抑制に関与するeIF2αのリン酸化が、温熱処理、TNF-α,IL-1βによっては有意な変化が生じなかったことだけを確認するにとどまってしまった。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに解明した糖尿病骨代謝異常の基盤病態及びその防御機構を、さらに詳細に解明していく。
小胞体ストレスの最初期で生じ、全般的翻訳抑制に関与するeIF2αのリン酸化は温熱処理、TNF-α,IL-1βでは増強せず、このためこれら処理では小胞体ストレスの誘導が生じていないと考えられるため、小胞体ストレスの詳細な検討は中止とし、温熱処理によるTNF-α,IL-1β刺激性MCP-1,VEGF120分泌増強の減弱に関与すると考えられる転写後調節の段階での制御機構の解明に推進する。
特に、選択的翻訳抑制の主幹をなすmicroRNAの関与を中心に検討する。初めに、次世代シークエンサーを使用したsmall RNA-seqにより網羅的に解析し、UMR-106においてTNF-α,IL-1β単独刺激に比較し、これに温熱処理を加えた群で変化するmicroRNAを絞り込む(IL-1βに関してはコントロール群とも比較する)。次にこの変化したmicroRNAをリアルタイムPCRもしくはデジタルPCRを使用し、変化レベルを詳細に定量化する。さらに、これら変化したmicroRNAのinhibitorやmimicを使用し解析する。さらに、これらmicroRNAと関連3'UTRの相互作用を、ルシフェラーゼを導入された3'UTRレポーターコンストラクトを使用し検討する。
これら実験により、温熱処理によるTNF-α,IL-1β刺激性MCP-1,VEGF120分泌増大の抑制機構を明確にする。
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| Causes of Carryover |
（理由)昨年度は職場環境における業務の負荷の増大など、研究以外の業務の増大のため、実験の遂行がかなり困難となり、その結果、eIF2αのリン酸化が、TNF-α,IL-1β、温熱処理によっては有意な変化が生じなかったことだけを確認するにとどまってしまったため。(使用計画)温熱処理によるTNF-α,IL-1β刺激性MCP-1,VEGF120分泌増強の減弱に関与すると考えられる転写後調節の段階での制御機構の解明に推進する。特に、選択的翻訳抑制の主幹をなすmicroRNAの関与を中心に検討する。初めに、次世代シークエンサーを使用したsmall RNA-seqにより網羅的に解析し、UMR-106においてTNF-α,IL-1β単独刺激に比較し、これに温熱処理を加えた群で変化するmicroRNAを絞り込む(IL-1βに関してはコントロール群とも比較する)。次にこの変化したmicroRNAをリアルタイムPCRもしくはデジタルPCRを使用し、変化レベルを詳細に定量化する。さらに、これら変化したmicroRNAのinhibitorやmimicを使用し解析する。さらに、これらmicroRNAと関連3'UTRの相互作用を、ルシフェラーゼを導入された3'UTRレポーターコンストラクトを使用し検討する。以上のことを実施するための試薬代、解析代を次年度計上する。
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Research Products
(1 results)
