血管新生抑制因子コンドロモジュリン-Iの特異的切断酵素とアンカー分子の同定

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K01800
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 開 祐司 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 教授 (40144498)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三浦 重徳 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (70511244)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: コンドロモジュリン-I / アンカー分子 / 切断酵素 / 軟骨マトリックス

Outline of Annual Research Achievements

前年度は、軟骨組織からのChM-I-アンカー分子複合体の抽出条件を最適化（2 M 尿素バッファー）し、ChM-Iモノクローナル抗体を用いた免疫沈降により共沈物を確認した。本年度は、最適化した抽出条件によりChM-Iを抽出した後、尿素濃度の異なる３つの乖離条件下で新たに免疫沈降を実施し、得られた沈降物の比較と再現性の確認を行った。さらに、より温和な条件でアンカー分子複合体を単離することを期待して、初代ラット肋軟骨細胞の培養液を用いた免疫沈降も並行して実施した。これらの条件で得られた免疫沈降物をSDS-PAGEで分離後、主要なバンド全てについてMS解析を行ったところ、18種類の軟骨マトリックス分子が同定された。また、液体クロマトグラフィーを用いた再会合実験においてもChM-Iとの相互作用が疑われる軟骨マトリックス分子2種が同定された。これらのうち、軟骨において豊富に発現し、複数の免疫沈降条件において共通して検出された分子6種類を有力な候補分子として選定し、タグ付き組換え体タンパク質の発現コンストラクトを作製した。哺乳類細胞を用いた無血清発現系において候補分子の発現・タグ精製を行い、これまでに6種類の候補分子について、FLAG-ChM-Iまたはウシ軟骨から粗精製した天然型ChM-Iとの免疫沈降を実施した。その結果、１種類のアンカー候補分子について、天然型ChM-Iとの相互作用が確認された。
ChM-I特異的切断酵素の同定については、軟骨細胞の後期分化とChM-I切断活性との関連性について検討を行った。ラット肋軟骨より採取した初代軟骨細胞を用いて肥大化・石灰化軟骨細胞への分化誘導を試みたが、分化誘導率が低く、ChM-I切断フラグメントは検出されなかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ChM－Iアンカー分子の探索については、20種の候補分子から絞り込んだ6種の中から、ChM-Iタンパク質と直接相互作用すると思われる分子１種を見出した。残り14種の候補分子についても、順次発現コンストラクトの作製または軟骨抽出液からの精製を計画しており、順調に進捗している。ChM-I特異的切断酵素の同定については、切断活性を有する軟骨細胞培養系が確立できておらず、検討課題を残している。

Strategy for Future Research Activity

引き続き精製ChM-Iタンパク質と候補分子の組換え体タンパク質等を用いて、直接的な相互作用の確認を行うとともに、siRNA等を用いた機能解析に注力する予定である。

Causes of Carryover

切断酵素同定のための軟骨分化培養系が確立できず、以降の実験を見合わせたため

Expenditure Plan for Carryover Budget

ChM-Iアンカー候補分子の機能解析および軟骨組織からの切断活性の分画等に使用する。