2017 Fiscal Year Annual Research Report
Investigation of interfaces on protein among aggregate on living cell
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15K01804
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
照屋 健太 東北大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (30372288)
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| Project Period (FY) |
2015-10-21 – 2018-03-31
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| Keywords | 異常型プリオン蛋白質 / クロスリンク / 多量体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
代表者は異常型プリオン蛋白質特異的に異常型どうしのクロスリンクを引き起こす系を発見した。細胞溶解液などの夾雑系でおいてにでも適応可能なこの系を用いて、感染伝播が観察される細胞系での異常型プリオン蛋白質凝集体中のモノマー間の相互作用面の解明とその相対的な配置の解明を試みている。昨年度までに、これらの反応条件の検討と、クロスリンク部位同定のための予備的な試験を実施した。その結果、抗体パネルを利用したマッピングにより、クロスリンク部位をプリオン蛋白質の一次構造上のある程度の領域にまで絞り込んだ。本年度はその領域をさらに絞り込み、クロスリンク体の分子的実体を明らかにするべく以下の研究を実施した。
クロスリンク体調製法をプリオン持続感染細胞から、感染マウス脳へと変更し、異常型プリオン蛋白質量を確保し、感染脳からの異常型プリオン蛋白質クロスリンク体の精製法を廃液量の抑制と、封じ込めを考慮しつつ確立した。また、追跡時に本クロスリンク反応の様式について更なる考察を付け加えた。すなわち、精製系でのクロスリンク反応を実施することで上記クロスリンク反応の特異性がより明確になった。
さらに、構造解析手法を抗体パネルによるマッピングから、ペプチドマスフィンガープリントを利用することとした。その際に、昨年度構築した、大腸菌リコンビナント調製蛋白を用いたデータリストを参照することができた。現在いくつかの蛋白質分解酵素を用いたフィンガープリントを実施したが構造の同定にはいたっていない。分解反応によるペプチドフラグメントのHPLCによる分画と併せて解析を進めているところである。クロスリンクに関して複数の領域内サイトの存在が示唆される。
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