2016 Fiscal Year Research-status Report
ウワバゲニンのLXRを標的とした内在性血圧調節因子としての機能解明
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15K01817
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
田村 理 岩手医科大学, 薬学部, 准教授 (30362619)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ウアバゲニン / 肝X受容体 / 生理活性 / 生体分子 / 上皮性ナトリウムチャネル / 集合尿細管細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に引き続き、肝X受容体(LXR)のリガンド結合部位(LBD)とウアバゲニン(OBG)の結合を直接的に評価する検討を行った。まず、等温滴定型カロリメトリー法(ITC)を用いた検討では、LXR-LBDにOBGを滴下した際の熱量変化がほとんど観測されなかった。基質としてT0901317を用いた際には非常にわずかながら反応が認められたことから、LXRとリガンドの親和性は比較的低く、OBGはさらに低いことが推察された。一方、SPAシンチレーションビーズと[3H]-OBGの相互作用についての検討も行った。しかしながら、結合応答を示すようなLXR-LBD、ビーズ、[3H]-OBGの混合比率は見出せなかった。そこで、次の方法として蛍光偏光を利用した検出に着目した。すなわち、蛍光基を結合したco-factorあるいは蛍光を発するLXRリガンドを用いて、OBGを作用させることでの蛍光偏光の変化を追跡する。既に蛍光基連結co-factorと蛍光LXRリガンドの合成は完了した。
一方、生物活性については、マウス腎臓集合尿細管由来M-1細胞に対して、上皮性ナトリウムチャネル(ENaC)の発現量を低下させる作用を見出し、また、本活性がLXRβサブタイプに依存していることを既に昨年度の時点で明らかにしている。今年度では、もともとM-1細胞内でのLXRαの発現量がβの1/100程度であることを考慮して、βノックダウンαノックイン状態のM-1細胞を使って再度検討した。その結果、αをノックインしてもENaCの発現抑制は回復しないことから、本活性にLXRαは関与していないことが示された。また、in vivoでの実験を行い、マウスに対してOBGを投与することで腎臓でのENaC発現が抑制されることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
肝X受容体(LXR)とウアバゲニン(OBG)の結合を直接的に評価する検討を複数(ITC, RI-labeled ligand)の方法を用いて行ったが、現時点では芳しい結果は得られていない。しかしながら、まだ、証明する方法（蛍光偏光の変化による観測）が残されているため、それに向けた準備としてリガンドや蛍光団を結合させたco-factorの合成を完了した。また、ドッキングスタディによるシミュレーションでは、OBGはLXRに選択的な親和性を示す結果が得られた。活性評価については、昨年度得られた結果をさらに詰めて、OBGのENaCの発現抑制がLXRのβサブタイプに依存していることを確実とする証拠を得ることができた。また、マウスを用いたin vivo実験へと展開し、OBGが動物実験においても腎臓でのENaC発現を抑制することを明らかに出来ている。結合の証拠が未だ得られていない点については今後さらに努力する必要を感じているが、生物活性について動物実験でポジティブな結果を得られた点は大きな進歩と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
合成した蛍光基連結co-factorおよび蛍光LXRリガンドを用いてOBGとLXRの直接的な結合を評価する検討を引き続き行う。生物活性については、LXRリガンドが一般的に脂肪肝を誘導する副作用を考慮して、OBGを作用させることによるin vivoでの肝トリグリセリド蓄積や、脂肪肝関連遺伝子の変動を追跡する。また、ヒト由来細胞への展開、マウスを用いた血圧測定を検討する。
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| Causes of Carryover |
昨年度４月に異動したことにより、研究に協力してくれる学生数が減ったため、消耗品の使用額が予定より若干少なかった。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
異動して２年目となり、研究に協力してくれる学生数が昨年度より増えているため、昨年度のように消耗品の使用額が少なくなることはないと考えている。そこで、当初の計画通りでウアバゲニンの生物活性評価やLXR関連リガンドの合成、LXR-ウアバゲニンの親和性評価等に使用する計画である。
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