2017 Fiscal Year Research-status Report
－１リボソーマルフレームシフトによる細胞内タンパク質の輸送・局在制御
| Project/Area Number |
15K01820
|
|---|
| Research Institution | Osaka University |
|---|
Principal Investigator |
村田 亜沙子 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (50557121)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | RNA高次構造 / 小分子化合物 / 翻訳－1フレームシフト / 翻訳制御 / バイオテクノロジー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，「小分子に誘起される－１リボソーマルフレームシフトにより，細胞内でタンパク質の輸送・局在を可逆的にコントロールする」ことである。平成29年度は以下の２つの項目に分けて研究を進めた。
研究計画(2) 翻訳－１フレームシフト効率を最大化する配列・リガンド構造を探索する: 前年度までに，翻訳－１フレームシフトを引き起こすことが知られているSimian retrovirus-1 (SRV-1) のシュードノット配列をNCT誘起型に改変し，NCT誘導体によりその二次構造が変化することをゲルシフトアッセイにより確認した。しかし，NCT誘導体が結合する標的配列の導入位置やその前後配列の違いにより，NCT誘導体によるゲルシフトすなわち二次構造変化が起こらない場合があり，NCT誘起型シュードノット配列のさらなる検討が必要であると考えられた。そこで，NCT誘導体の標的配列の導入位置や前後配列が異なるSRV-1シュードノット配列を種々検討し，ゲルシフトアッセイによる評価を行った。
研究計画(3) 細胞内翻訳－1フレームシフトによりシグナルペプチドの付加を制御する: 前年度までに，NCT誘導体が細胞内でmRNA上にシュードノット構造を誘起し（MMTVシュードノット配列由来），翻訳－1フレームシフトを引き起こすことを，デュアルルシフェラーゼレポーター（Rluc, Fluc），デュアル蛍光タンパク質レポーター（mCherry, EmGFP）を用いたアッセイにより明らかにした。本年度は，NCT誘導体により誘起されるフレームシフトの詳細を調べるために，NCT誘起型シュードノット配列の下流に読み枠の異なる３種類エピトープタグ配列を導入し，NCT誘導体添加で変化した翻訳産物の同定を行った。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究計画(2). 翻訳－１フレームシフト効率を最大化する配列・リガンド構造を探索する: おおむね順調に進展している。SRV-1のシュードノット配列にNCT誘導体の標的配列を導入したRNA配列では，標的配列の導入位置やその前後配列の違いにより，NCT誘導体によるゲルシフトすなわち二次構造変化が起こらない配列があった。翻訳－１フレームシフトが起こるためには，mRNA上にシュードノット構造が誘起されることが必須である。そこで，当初計画していたデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイおよびウエスタンブロッティングによる，NCT誘起型SRVシュードノットのフレームシフト誘導効率の算出と並行して，NCT誘起型SRVシュードノット配列の検討およびゲルシフトアッセイによる評価を行った。その結果，NCT誘導体によるシュードノット形成に必要な配列情報を得ることができた。
研究計画(3)． 細胞内翻訳－1フレームシフトによりシグナルペプチドの付加を制御する: おおむね順調に進展している。NCT誘導体により誘起されるフレームシフトの詳細を調べた。NCT誘起型シュードノット配列の下流に読み枠の異なる３種類エピトープタグ配列を導入し，NCT誘導体添加で変化した翻訳産物の同定を行ったところ，－1フレームシフト翻訳産物のみが検出され，他のフレームシフト（－２, +1）翻訳産物は検出されなかった。エピットープタグとシグナルペプチドは短いペプチド配列という点で共通しており，上記結果は，NCT誘導体による翻訳－１フレームシフトの誘起をシグナルペプチドの付加に応用できることを示唆するものである。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度に得られた研究成果をもとに，NCT誘導体による翻訳－１フレームシフトの誘起を細胞内シグナルペプチドの付加の制御に応用する（NCT誘起型MMTVシュードノットを用いて行う予定）。また，NCT誘起型SRV-1シュードノット配列を用いて，翻訳－１フレームシフト効率を最大化する配列の取得を目指す。
|
| Causes of Carryover |
前年度の研究計画（化合物とRNA配列の最適な組み合わせ探索）に若干の変更があり，それに伴い当該年度に行った実験の結果，当初の見込み額と執行額は異なった。また，研究代表者の産前産後休暇，育児休業の取得に伴い，当初予定していた研究計画を一部次年度に行うこととしたため，次年度使用額が生じた。研究全体の計画について大きな変更はなく，当初予定していた計画に沿って研究を進める。
|
