2018 Fiscal Year Annual Research Report
Induction of -1 ribosomal frameshifting by a small molecule and its application to protein transport and localization
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15K01820
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
村田 亜沙子 大阪大学, 産業科学研究所, 助教 (50557121)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | RNA高次構造 / 小分子化合物 / 翻訳－１フレームシフト / 翻訳制御 / バイオテクノロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は，「小分子に誘起される－１リボソーマルフレームシフトにより，細胞内でタンパク質の輸送・局在を可逆的にコントロールする」ことである。平成30年度は以下の２つの項目について研究を進めた。
研究計画(2) 翻訳－１フレームシフト効率を最大化する配列・リガンド構造を探索する: 前年度までに，種々のNCT誘起型Simian retrovirus-1シュードノット(SRV-1-PK)のデザイン・in vitro合成を行い，それらの二次構造がNCT誘導体でどのように変化するかをゲルシフトアッセイにより調べた。ゲルシフトアッセイにより，NCT誘導体の結合により２次構造変化が示唆されたSRV-1-PK変異体を，二種類のルシフェラーゼ配列の間に挿入したレポーターコンストラクトを作製した。これを鋳型としてNCT誘導体の有無でin vitro翻訳反応を行い，NCT誘導体の 翻訳－１フレームシフトへの効果をデュアルルシフェラーゼアッセイにより評価した。その結果，NCT誘導体の添加に伴い翻訳－１フレームシフト効率の低下が観察され，期待した二次構造を形成していないことが示唆された。
研究計画(3) 細胞内翻訳－1フレームシフトによりシグナルペプチドの付加を制御する: 前年度までに，NCT誘起型MMTVシュードノット配列の下流に読み枠の異なる３種類エピトープタグ配列を導入し，NCT誘導体添加で変化した翻訳産物の同定を行った。その結果を受け，GFP配列と細胞膜移行シグナルであるK-RasのCaaXモチーフの間にNCT誘起型MMTVシュードノット配列を導入したレポーターコンストラクトを作製し，NCT誘導体による細胞膜への移行を評価した。その結果，NCT誘導体の有無によるGFPの細胞内局在変化は明確には観察されなかった。これは，フレームシフト効率がGFPの細胞膜への移行を観測できるほど高くないことが理由であると考えられ，NCT誘起型MMTVシュードノット配列のさらなる最適化と検出感度の向上が期待された。
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