2015 Fiscal Year Research-status Report
標識化バフィロマイシン誘導体の合成を基盤とした液胞型ATPアーゼ阻害機構の解明
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15K01821
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
土川 博史 大阪大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (30460992)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | Bafilomycin / V-ATPase / フッ素標識 / 化学合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では液胞型プロトン－ＡＴＰアーゼ（V-ATPase）を特異的に阻害する天然物であるバフィロマイシン（Baf）に着目し、化学合成を基盤とした複合体構造解析を実施することで、阻害機構の解明を目指す。まずは固体ＮＭＲ測定法としてREDOR法を適用することを考慮し、Bafの適切な位置に19Fや13C標識を導入した誘導体の調製を行うこととした。
本年度はまず新たなフッ素標識体として、2位のメトキシ基をフッ素原子で置換したBaf誘導体の合成を行い、その活性を確認した。
2-F-Bafは天然物の全合成例を参考に3つのセグメントを順次連結することで合成した。すなわち、まず文献既知のアルデヒドに対してフルオロオレフィン化反応を用いてフッ素原子を導入することでフッ素置換セグメント（C1-11）を合成した。その後、これと文献既知のC12-17セグメントをStilleカップリングにより連結し、加水分解の後、山口条件で環化させることでマクロラクトンセグメントを構築した。さらに得られたマクロラクトンセグメントから数段階を経てアルデヒド体へと変換後、別途調製したC18-24セグメントとアルドール反応により連結し、最後に脱保護を行うことで2-F-Bafの合成に成功した。続いて合成した2-F-Bafの生物活性を評価した。酵母液胞膜を用いたV-ATPase阻害活性試験を実施した結果、2-F-Bafは天然物に匹敵する強力な阻害活性を保持していることが示された。これによりマクロラクトンの配座解析を行うために必須である、活性を保持したフッ素標識化Baf誘導体を得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の主たる目的は、化学合成によってのみ調製可能なBaf標識体を駆使し、巨大で複雑な膜タンパク質であるV-ATPaseとの複合体構造を明らかにすることである。今年度において、まずは第一関門である活性を保持したフッ素標識体の調製に成功した。これにより、実際に固体ＮＭＲ構造解析に用いる19F, 13C二重標識体の合成法をほぼ確立したと言えるので、研究はおおむね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度までに強力な活性を保持した２種類のフッ素標識化Baf誘導体（24-F-Bafおよび2-F-Baf）の合成に成功したので、平成28年度は、実際に固体ＮＭＲ測定を行うために19F, 13C二重標識体の合成を行う。まずは比較的合成しやすい24-F-1,2-13C-標識体を合成標的とした。24-F-Bafの合成で確立した合成法を適用し、炭素13標識については、C1,C2位を増炭する試薬の13C標識体を調製して用いる予定である。
また同時に固体ＮＭＲ測定に必要なタンパク質試料の調製も行う。まずは大量培養が容易な出芽酵母(S. cerevisiae)を用い、V-ATPaseを含む液胞膜小胞の単離精製を検討する。続いて得られた液胞膜中に含まれるV-ATPaseの量を定量し、固体ＮＭＲ測定が可能な純度と量が確保されているかを判断する。もし不十分である場合は、サブユニットaのC末にTAPタグを発現させた菌株を培養し、V-Apaseを含む膜成分を単離・可溶化することでさらなる精製、および必要であればVoドメインの単離についても検討する予定である。
次に固体ＮＭＲ測定に用いるサンプルの条件を決定する。まずは標識化Bafの感度限界を見積もるために、濃度の異なるBafのみでパウダー状態での測定を行い、最適な濃度を決定する。さらに測定サンプルの状態(脂質リポソームに含有させるかや凍結乾燥サンプルかなど)の検討も行い、実際に用いる条件の最適化を行う。
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[Presentation] Design, synthesis and biological evaluation of fluorinated bafilomycin analogues as an NMR probe to analyze the interaction with vacuolar-type ATPase2015
Author(s)
H. Tsuchikawa, H. Shibata, T. Hayashi, S, Hanashima, N. Matsumori, M. Murata, T. Usui
Organizer
PACIFICHEM 2015
Place of Presentation
Honolulu, Hawaii, USA
Year and Date
2015-12-15 – 2015-12-20
Int'l Joint Research
