2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K01825
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
坂本 寛 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 教授 (70309748)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平 順一 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 助教 (20549612)
小松 英幸 九州工業大学, 大学院情報工学研究院, 助教 (90253567)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ヘム / センサー / 生体分子 / 酵素 / 分析科学 / 計測 / 定量 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
目的
ヘムは分子補欠族として様々なヘム蛋白質の機能発現に寄与しているが，近年，遊離状態のヘムが転写制御因子の活性化に関与している事例が次々に明らかになり，細胞機能に対する調節作用も有していることがわかってきた。しかし，細胞内に遊離ヘムがどのぐらいあるのか，またどこにあるのかさえ未だ明らかにされていない。そこで，我々は独自に開発した蛍光ラベル化ヘムオキシゲナーゼ-1（HO-1）をヘム特異的ヘムセンサーとして用いるヘム定量法により次のことを行う。①組織，細胞などの生体由来サンプルを用いてヘム濃度を計測できる測定系を確立する。②センサーを改良し，遊離ヘムが細胞内のどこにあるか，その動態を明らかにするためのプローブを開発する。それにより，遊離ヘムの細胞内動態を明らかにする。
結果
①現行センサーを用いた生体試料中のヘム濃度測定法の確立：各種界面活性剤またはカオトロピック剤を用いて、ヘムタンパク質への影響と薬剤処理濃度別ミクロソーム分画中のヘム検出量の増加を検討したところ、イオン性の界面活性剤やカオトロピック剤ではタンパク質の変性を伴ったヘム検出量の増加がみられたが、非イオン性界面活性剤ではヘムタンパク質を壊さずに選択的にヘムの非特異的な吸着の解消効果が示唆された。
②遊離ヘム特異的蛍光プローブの開発と細胞内ヘムの動態観察：ラットヘムオキシゲナーゼ-1（rHO-1）のC末端への蛍光蛋白質の融合はヘム濃度に応じた蛍光強度変化を示さなかった一方で、N末端に蛍光蛋白質を融合したrHO-1の蛍光強度はヘム濃度に対応して変化することが示唆された。そこで、この融合蛋白質中のrHO-1のcDNAに対してヘム分解活性を失くす変異（D140H）を導入し、哺乳細胞内に発現させたところ、細胞内のヘム合成の亢進に対応した融合蛋白質の蛍光強度変化が認められ、細胞内ヘムプローブとしての応用が可能であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生体由来試料中の遊離ヘムを測定する場合，遊離ヘムが生体物質に非特異的に吸着し，測定に支障を来すことが示唆された。そこで，様々な添加剤を検討した結果，非イオン性界面活性剤が有効であることがわかった。一方，蛍光蛋白質融合型HO-1を発現した細胞では，ヘム合成の程度によって蛍光強度の違いが確認され，細胞内ヘムプローブとしての応用が期待できる。また，連携研究者との共同研究により，フローサイトメトリーを用いた計測を開始した。さらに，特異的蛋白質相互作用を利用した発光型ヘムセンサーの構築を開始した。
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| Strategy for Future Research Activity |
蛍光タンパク質融合HO-1を生細胞内で発現させ，ヘム合成亢進に対応したヘム応答性をフローサイトメトリーを用いて観測する。また，蛍光顕微鏡を用いた細胞内遊離ヘムの可視化を検討する。発光型ヘムセンサーを用いたヘム検出系の構築を行う。
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| Causes of Carryover |
計上していた旅費を運営費交付金および他の受託研究費から支出したため。また，物品購入において，実験に必要な消耗品が一部値下がりしていたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度の消耗品購入の際に使用する。
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