2016 Fiscal Year Research-status Report
単一生細胞での細胞内遺伝子センシング技術の開発とチップデバイス化
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15K01829
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
青木 寛 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 環境管理研究部門, 主任研究員 (00392580)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 遺伝子センシング / バイオマーカー / マイクロRNA / 顕微イメージング / チップデバイス / 電気化学検出 / 表面プラズモン共鳴 / ナノ粒子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、単一生細胞での細胞内遺伝子センシング技術を開発しそれをチップデバイス化することで、多数の細胞内遺伝子活動を並列的に同時観測可能とし、簡便かつ迅速な遺伝子診断技術の構築を目指す。最終的には、臨床や環境の現場で使用可能な一次スクリーニング技術として統合し、テーラーメード医療や化学物質の生体影響評価に貢献する。
この課題のもと、H28年度は、表面プラズモン共鳴（SPR）イメージング法／顕微イメージング法に基づく検討を行った。
まずSPRイメージング測定では、相補的な配列を有するDNAをプローブとして金表面上に固定化して配列選択的なターゲット認識を行い、その後の酵素反応によりシグナル増幅を図ることとした。具体的には、ターゲットであるマイクロRNA（miRNA）の認識後、酵素反応miRNA末端にpoly(A)鎖を伸長させ、複数のシグナル増幅因子添加後、TMB/H2O2混合溶液添加により酸化TMB（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine）の青色沈殿を生成させることで、シグナル増幅を行った。この際、酵素反応後にタンパク質分解酵素を反応させることでバックグラウンドシグナルを減少させてS/N比を向上させるとともに、シグナル増幅因子の添加割合や添加方法を検討することで最適化を行った。本研究の結果、肺がんマーカーである鎖長22 merのmiRNAに対して、検出下限がpMレベルであることを確認した。次に、SPR顕微イメージング測定法に基づく高感度検出では、生体試料のモデルとして単糖類マンノースをターゲットとし、これを選択的に捕捉するレセプターであるコンカナバリンＡを表面固定化したハイドロゲルナノ粒子を用いた。この研究では、ナノ粒子表面でマンノースが選択性良く分子認識されることを見出し、この手法が微量生体試料測定に有用であることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H28年度は、H27年度に判明した新たな検討事項であるSPRイメージング法／顕微イメージング法によるmiRNAの高感度検出法の開発に取り組んだ。具体的には、簡便・迅速な測定のための新規プローブと測定原理の開発、および酵素反応を活用した高感度測定法の開発を試みた。さらに、高感度検出に不可欠な、酵素反応後のバックグラウンドシグナルの除去手法、および酵素反応におけるシグナル増幅の最適化手法も開発した。最終的に、肺がんのバイオマーカーとなるマイクロRNAの配列選択的な非標識検出に成功した。併せて、SPR顕微イメージング測定法に基づいたナノ粒子表面での微量生体試料の高感度検出にも挑戦した。以上のことから、おおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
申請者の技術である電気化学的手法と、本年度習得したSPRイメージング法／顕微イメージング法との両方の特徴を活かしたマイクロデバイスを作製するとともに、研究終了後の実用化検討に向けて、モニタリングすべき遺伝子バイオマーカーの探索を推進する。
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| Causes of Carryover |
他の予算が使用不可能な年度末、年度初めに、消耗品等の購入に本予算を使用するため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H29年度に消耗品等の購入に使用予定。
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