2016 Fiscal Year Research-status Report
生体脳内シナプス可塑誘導刺激にともなうアストロサイト動態変化の慢性計測
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15K01841
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
三嶋 恒子 国立研究開発法人理化学研究所, 脳科学総合研究センター, 研究員 (90415307)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | アストロサイト / 可塑性 / カルシウムシグナル / グリア |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題は神経回路の可塑性に伴うアストロサイトの形態およびカルシウムシグナル動態を、時間変化・可塑性誘導の刺激強度の変化との関係性において明らかにすることを目的とする。Arc-dVenus トランスジェニックマウスを利用することで刺激により可塑的変化を起こした神経細胞を可視化・同定し、同時に観測領域内に導入したGFAPプロモーター付きのアデノ随伴ウイルスベクターにより、アストロサイトを可視化、二光子顕微鏡により観察し解析を行う。
本年度は、昨年度検討したウイルスベクタ3種（形態観察にはmCherryもしくはmemCeruleanの蛍光タンパク、カルシウムシグナル観察用にはRCaMP蛍光カルシウムプローブを発現するもの）を用いた。可塑性誘導刺激の前後でこれらのウイルスベクタを導入したアストロサイトの形態・カルシウム動態の二光子顕微鏡観察を行った。神経細胞が可塑的変化をしていると考えられる領域では、変化のない領域とは異なるカルシウムシグナルの自発活動のパターンを観測できた。
これまでの可塑性誘導刺激(single whisker-experience: ヒゲを1本だけ残し、他を切り落とす)にくらべ、刺激強度を定量的に変化させることがより容易であるような、可塑的変化を誘導する刺激として経頭蓋直流電気刺激（tDCS: trasncranial direct current stimulationの導入を検討した。刺激後アストロサイトのカルシウムシグナルの頻度が上昇することがすでに報告されている。ここではアストロサイトとアストロサイトと同じグリアの1種であるミクログリアの形態変化を固定脳で調べた。その結果、この可塑性誘導刺激を受けた動物のミクログリアの形態が、麻酔下での刺激では変化がないのに対し、覚醒状態で刺激を受けた場合は有意に変化することが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
初年度の機器類の故障・破損のため計画が後ろ倒しになっている。またそれにくわえ、研究計画の大幅な見直しにせまられ、それに伴う予備実験のため計画は遅れている。
研究計画の見直しは主にウイルスベクタ（GFAP-memCerulean, GFAP-mCherry)の問題による。GFAP-mCherryは脳内での凝集が起こり、アストロサイトの細かい部分の形態を見る場合、この凝集があると変化を抽出するのが難しいことが分かった。またGFAP-memCeruleanは、この発現自体が安定した可塑性誘導に影響を与えている可能性が否定できない結果が出てきた。そのため、アストロサイトの形態観測自体が難しくなってしまった。そこで現在はGFAP-RCaMPによるカルシウムシグナルの変化を中心に観測・解析を行い、主にデータの取得を主に当該年度は進めることができた。現在は解析待ちの状態である。以上と並行して、アストロサイトの微小な形態変化のかわりに、同じグリアの仲間であり、アストロサイトとの関係をもつミクログリアの形態変化の観測をおこなっている。この新たな代替実験はより刺激強度を定量的に変えることの容易な可塑性誘導刺激のプロトコルへ変更して検討を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒゲの処理での可塑的変化プロトコルを（single whisker experience)適用した動物の脳の二光子イメージングした結果の解析を行う。可塑的変化誘導領域と、非誘導領域をArc-dVenusの発現の有無によって同定し、両領域におけるアストロサイトのカルシウムシグナルの分布、シグナルの大きさ・時間・頻度などのパラメータについて比較する。可塑的変化の誘導領域をArc-dVenus発現神経細胞の密度によって定量化し、可塑的変化の大きさとの関連を調べる。
また、異なる可塑的変化の誘導プロトコル、経頭蓋直流電気刺激によるミクログリア形態変化をしらべる。ミクログリアの形態変化はアストロサイトのカルシウムシグナル変化と大きくかかわっている可能性があり、さらにこちらは刺激強度の定量的な調節が容易であるため刺激強度とアストロサイトの動態変化との関連を調べるための新たな方策として当初の研究プランのの代案として進めてゆく予定である。
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| Causes of Carryover |
現在までの使用機器の破損及び新たな検討事項が生じたため、研究進行が遅延しているため購入に至っていない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
データの解析のための計算機(コンピュータ)および、高感度カメラ一式を購入予定。
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