2017 Fiscal Year Research-status Report
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15K01842
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
岩瀬 克郎 千葉大学, 大学院医学研究院, 講師 (80322030)
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2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 恐怖条件付け / 記憶学習 / 神経ペプチド / 光環境 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に引き続き、学習や想起時の光環境がセクレトグラニンII遺伝子欠損（Scg2 KO）マウスのすくみ反応に及ぼす影響について検証を行った。遺伝的背景がB6系統のマウスでは、これまでに得られていた音刺激をきっかけとした想起でのすくみ反応抑制傾向が、明環境下、暗環境（赤外線ライト環境）下ともに引き続き示された。それに加えて明環境下においては、恐怖条件付学習時、海馬依存的な文脈的想起でも、Scg2 KOマウスのすくみ反応に抑制傾向が認められた。一方で、遺伝的背景がB6-129混合系統では実験個体数が増えたことにより、前年度までは見られていた暗環境下での Scg2 KOマウスのすくみ反応の亢進傾向は認められなくなった。
さらに心的外傷後ストレス障害（PTSD）治療法の開発にScg2 KOマウスを活用するための端緒として、電気刺激と音による恐怖条件付け学習の後、条件付け時とは異なる波長の音に対するすくみ反応を確かめた。実験数の少ない予備的実験の段階であるが、現在のところ野生型とScg2 KOマウスの間で差異は認められない。
また、これまでにデータベース検索並びにOrphan GPCRパネル解析により選別したScg2由来神経ペプチド受容体候補遺伝子について、蛍光カルシウムプローブを用いた細胞内Ca2+イオン濃度の変化を指標に細胞内応答性を確かめたが、明らかな変化は認められなかった。一方で、Scg2由来神経ペプチド受容体検索の別なアプローチとして、合成したScg2由来神経ペプチドを利用して、同ペプチドに結合するタンパク質の選別を行った。脳組織、あるいは神経芽細胞腫由来細胞Neuro2aより抽出したタンパク質画分と、Scg2由来神経ペプチドを混合して電気泳動を行い、結合によって泳動パターンが変化するタンパク質を検索した。その結果、有力な結合タンパク質遺伝子の候補が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
電気刺激と音刺激の組み合わせによる恐怖条件付け学習、並びにその後の想起によるすくみ反応について、Scg2 KOマウスを用いた検証を進めている。個体差が大きいため、明らかな有意差を得るには至っていないが、B6系統のマウスにおいては通常の明環境下で、恐怖条件付学習時、海馬依存的な文脈的想起、音刺激をきっかけとした想起いずれにおいても、Scg2 KOですくみ反応の抑制傾向が示されている。一方、条件を暗条件にした場合では、音刺激をきっかけとした想起ではすくみ反応は抑制気味であるが、恐怖条件付学習時や海馬依存的な文脈的想起ではあまり抑制は見られておらず、光環境によって、Scg2 KOによるすくみ反応の抑制に差異がある可能性が示唆されている。
またScg2遺伝子の脳内での発現は、生体のリズム発信の中枢とされる視交叉上核で特に高く、日周リズム形成に関与することが予想されることに加え、活動期と休眠期ではショック等のストレスに対する感受性等が異なる可能性がある。学習時の光環境だけでなく、日周リズムの時間の違いも、Scg2 KOによるすくみ反応抑制に影響するのか、これから検証を進めるところである。
Scg2の作用機序を明らかにする上で受容体の性状の解析は不可欠であるが、Scg2由来神経ペプチド受容体の同定については遅れている。データベース検索やOrphan GPCRパネル解析から候補として上がった遺伝子に関しては、Scg2由来神経ペプチドに対する明らかな応答性は確認できなかった。しかしながら、別のアプローチによる検索から、Scg2由来神経ペプチドに結合する機能を持つと予想される遺伝子が得られており、今後、結合様式等について、検証を進める。
以上から、本研究は概ね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在得られているScg2 KOマウスのすくみ反応の傾向について、結果の信頼性を上げるため、個体数を増やしてさらに検証するとともに、以下の解析を進める。
（１）日周リズムがすくみ反応抑制に及ぼす影響についての解析：マウスは12時間明・12時間暗の周期での飼育し、通常は、明期（休眠期）のマウスを恐怖条件付け学習に用いるが、日周活動リズムが記憶・学習に与える影響を確かめるため、暗期（活動期）のマウスを用いて恐怖条件付け学習試験を行う。日周リズムの時間の違いによりすくみ反応に変化があるのか、またScg2 KOによるすくみ反応の抑制に日周リズムがどのように影響するか、これまでに得られている結果と比較し、検証する。
（２）Scg2由来神経ペプチド結合タンパク質の解析：Scg2由来神経ペプチドとの結合が確認された遺伝子について、その結合力や結合様式を、ビアコアによる解析、in silicoによる結合予測モデル等で明らかにする。また、同遺伝子を培養細胞で発現させ、蛍光カルシウムプローブを用いた細胞内Ca2+イオン濃度の変化の確認、あるいはルシフェラーゼアッセイ等により、Scg2由来神経ペプチド刺激に応答した細胞内シグナル伝達にこの結合が関与しているか確かめる。
（３）血管新生に対するセクレトニューリン関連ペプチドの効果の確認：セクレトニューリンは血管新生を亢進させる作用があることが報告されており、血管新生を指標とした実験系はセクレトニューリンの作用を調べる上で有効である。セクレトニューリンの作用を標的とした効果的なアゴニストあるいはアンタゴニストを検索する端緒として、鶏胚漿尿膜上にセクレトニューリンやその部分的ペプチド、変異ペプチド等を作用させ、血管新生への影響を確かめる。
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| Causes of Carryover |
理由：次年度まで期間を延長し、試験時の光条件や日周リズムがScg2KOマウスのすくみ反応抑制に与える影響について、より精緻な検討を行うこととしたため。
使用計画：Scg2KOマウスの維持・管理に係る飼料やチップ等の物品を購入する。Scg2由来神経ペプチド受容体の同定や細胞内シグナル伝達経路の解析に必要な試薬類、酵素類、器具類等を購入する。
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Research Products
(1 results)
