2016 Fiscal Year Research-status Report
バイオトランジスタによるタンパク質翻訳後修飾の電気的検出
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15K05530
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
合田 達郎 東京医科歯科大学, 生体材料工学研究所, 助教 (20588347)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | バイオトランジスタ / 翻訳後修飾 / ヒストン / アセチル化 / 水晶発振振動子 / 表面プラズモン共鳴 / ＤＮＡアプタマー / タンパク質吸着 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、分子認識にともなう界面電荷密度変化を電気的に直接検出する「バイオトランジスタ」を用いて、生命現象に深くかかわるタンパク質の翻訳後修飾を非標識に検出する手法を開発する。セリン残基のリン酸化等、いくつかのタンパク質翻訳後修飾では、アミノ酸側鎖の電荷が変換される。このことに着目し、タンパク質分子の重さと電荷密度という異なる物理量を同時に検出するために、水晶発振振動子（ＱＣＭ）とバイオトランジスタを統合した新たなバイオセンサーを開発することを目指した。遺伝子の転写調節を司るヒストンのメチル化およびアセチル化をモデル系として、タンパク質の翻訳後修飾の電気的検出をおこなった。ヒストンアセチル化はリジン残基の正電荷を奪い、クロマチン構造を弛緩させることによって、ＤＮＡの転写を促進させる役割を有している。翻訳後修飾による転写異常は組織の眼科と密接に関連しており重要な課題である。
そこで、まずリコンビナントなヒストンプロトマー（Ｈ３、Ｈ４）を用いて、アセチル化試薬（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）によるリジン残基のアセチル化をおこなった。また、タンパク質と試薬の混合比を調節することで、アセチル化度の異なるヒストンを作製した。次に、バイオトランジスタを用いて、ヒストン特異性ＤＮＡアプタマーを固定化した電極表面に対し、ヒストンを選択的に吸着させ、電位変化を計測した。また、同じ表面修飾を施したＱＣＭセンサーチップを用いて、ヒストンの吸着した重量を求めた。そして、アセチル化度に対するヒストンの電荷／重量比を算出し、原理証明実験をおこなった。
また、タンパク質分子の電荷と重量を同一の電極表面で同時に計測するバイオトランジスタ・表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）一体型センサーを新たに開発した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまで、モデルサンプルを用いたヒストンのアセチル化度の測定には成功したが、十サンプルによる測定が難航している。その結果、ヒストンメチル化度の実験には未着手である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒストンのアセチル化に関する測定を、実サンプルを用いて、引き続き検討する。実サンプルとして、株化ヒト培養細胞からヒストンを回収する。アセチル化度を制御するためにヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）阻害剤とヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＴ）阻害剤を用いる。ＨＡＴ阻害剤としてはＣｕｒｃｕｍｉｎ、ＨＤＡＴ阻害剤としてはＡｐｉｃｉｄｉｎを用いる予定である。
また、バイオセンサーの高感度化・安定化を検討する。実サンプルによる測定の困難さの一つは測定感度とシグナル安定性にあることがこれまでの研究から新たに判明した。そこで、用いる電極の品質の向上や、バイオトランジスタ・ＳＰＲ一体型センサーの開発に取り組み、本課題を解決する予定である。
ヒストンアセチル化の測定に成功すれば、次に、アルツハイマー病のバイオマーカーであるタウタンパク質のリン酸化度の測定に関するモデル実験に取り組む。タウタンパク質の電極表面への吸着には、核酸アプタマーを用いる予定である。
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| Causes of Carryover |
実サンプルを用いた実験が遅れたことにより、当初予定していた実験が実施できなかった。したがって、主に、物品購入費に関して繰り越しが生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実サンプルを用いた実験や、センサーの品質改良およびバイオトランジスタ・ＳＰＲ一体型センサーの開発に用いる予定である。
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