2016 Fiscal Year Research-status Report
ファージインターフェース制御技術の確立とバイオセンシングへの応用
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15K05541
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
渡辺 茂 高知大学, 教育研究部総合科学系複合領域科学部門, 教授 (70253333)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
波多野 慎悟 高知大学, 教育研究部総合科学系複合領域科学部門, 助教 (70397157)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 金ナノ粒子 / 比色検出 / 細菌 / 凝集 / 静電相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
宿主細菌に対して特異的に感染する“バクテリオファージ”の生物機能に着目し，免疫反応に代わる新奇な検出技術の開発を目指している．これまで金ナノ粒子の凝集比色を利用した細菌の検出原理を実証し，表面が負電荷を帯びている細菌の検出には，静電相互作用がきわめて重要な役割を担うことをつきとめた．しかし，アミノエタンチオール修飾金ナノ粒子など代表的なカチオン性金ナノ粒子は，分散安定性に乏しくファージ分子を担持させる際，容易に凝集体を形成し，足場ナノ粒子として利用できないことがわかった．今年度は，分散安定性に優れたカチオン性金ナノ粒子を得るため，クエン酸還元金ナノ粒子を出発物質として，その粒子表面に水素化ホウ素ナトリウムで還元した還元ウシ血清アルブミン（dBSA）を担持させたdBSA保護金ナノ粒子（dBSA-AuNP）を調製した後，その水溶液にpoly(diallyldimethylammonium chloride)（PDDA）を添加し，粒子表面をPDDAで修飾したカチオン性金ナノ粒子（PDDA-AuNP）を合成した．
さらに，その足場ナノ粒子として有用性を確認するため，表面に抗菌・抗ウイルス作用など幅広い生物活性を示す多機能タンパク質“ラクトフェリン（Lf）”を担持させ，細菌の比色検出について検討した．アニオン性金ナノ粒子にLfを担持させたラクトフェリン修飾金ナノ粒子では，その水溶液に大腸菌や黄色ブドウ球菌などの細菌を加えても，細菌表面に金ナノ粒子が結合している様子が全く観察されなかった．一方，PDDAで被覆したカチオン性金ナノ粒子にLfを担持させたラクトフェリン修飾金ナノ粒子では，細菌表面で金ナノ粒子が凝集体を形成している様子がみられ，その水溶液は赤色から青色へと劇的な色調変化を示し，目視で大腸菌や黄色ブドウ球菌などの細菌を検出できることがわかった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初年度に引き続き，細菌特異的に感染する“バクテリオファージ”に着目し，その細菌特異性を担う尾部リガンドタンパク質（以下，ファージ分子）を新たな抗体代替分子として，粒子表面に担持させたファージ分子修飾金ナノ粒子の合成方法について検討した．カチオン性合成高分子を利用し，積年の課題であった分散安定なカチオン性金ナノ粒子を得ることには成功した．しかし，粒子表面にファージ分子を担持させる際，ファージ分子が安定な高濃度の緩衝液中では，金ナノ粒子が凝集し，金ナノ粒子が安定な緩衝液濃度下では，逆にファージ分子が凝集するなど粒子表面にファージ分子を担持させる合成条件について，最適化するには至らなかった．
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| Strategy for Future Research Activity |
分散安定なカチオン性金ナノ粒子を合成したが，金ナノ粒子が分散安定な水溶液ではファージ分子が凝集し，ファージ分子が安定な水溶液では金ナノ粒子が凝集してしまうなど，粒子表面にファージ分子を担持させる合成条件について，最適化するには至らなかった．そこで，次年度には，ファージ分子に代わってファージ自身を凝集させることなく分散安定な条件下，直接粒子表面に担持させる合成条件について検討する．具体的には，分岐状ポリエチレンイミン（bPEI）を還元剤および表面保護剤として，ポリエチレンイミン還元金ナノ粒子（bPEI-AuNP）を合成し，ファージの頭部表面に存在するカルボキシル基をN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）とエチル(ジメチルアミノプロピル) カルボジイミド（EDC）を用いて活性エステル（-CONHS）へと変換した後，bPEI-AuNPと反応させることで，金ナノ粒子表面に共有結合（-NHCO-）を介してファージを固定化し，ファージ修飾金ナノ粒子を合成する．さらに，ファージ修飾金ナノ粒子を利用した病原性細菌の検出について検討する．
また，蛍光色素を内包させた蛍光性高分子ミセルおよび蛍光性ナノエマルジョンを作製し，これらの表面にファージを担持させたファージ蛍光プローブの開発に取り組む．
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| Causes of Carryover |
学内の競争的資金を獲得したこともあり，溶媒，ガラス器具，分光器の光源など各研究課題に共通する消耗品の一部を購入した．そのため当初計上していた物品費が予定額を下回った．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実施計画の最終年度では，特にボトルネックとなっている分散安定なカチオン性金ナノ粒子の合成を活発に進めることを計画している．原材料となるテトラクロロ金(III)酸（和光純薬工業，10 g，59,000円）を150 g～180 g程度消費することが予想される．これら試薬類など消耗品の購入および研究を遂行する上で不可欠な分析機器の維持管理および修理費として使用する予定である．
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Research Products
(3 results)
