2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K05555
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
松井 敏高 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (90323120)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ヘム代謝 / 酵素反応 / 反応機構 / 病原性細菌 / 水酸化ヘム / 酸素活性化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、黄色ブドウ球菌由来の新型ヘム分解酵素（IsdG）の詳細な反応研究を進め、歪みに誘起される特殊なヘム分解機構解明を目指した。IsdGは基質であるヘムを異常に歪めて結合させることで、スタフィロビリン（SB）とホルムアルデヒド（HCHO）という特殊なヘム代謝物を与えると報告されていた。しかし今年度の反応解析によって、HCHO遊離は限定的な条件（Trisバッファー中、シングルターンオーバー）でのみ支配的であり、他の条件ではHCHOを遊離しない分解反応も進行した。得られた新規生成物は"ホルミル基が結合したSB"（SB-CHO）と予想されたが、HPLC及びESI-MSによる解析の結果、反応に用いた還元剤（アスコルビン酸）の付加が確認された。アスコルビン酸は生理的な還元剤とは考えにくく、その付加体はアッセイ条件に依存するアーティファクトと考えられる。そこで還元酵素（CPR）や低濃度アスコルビン酸によるヘム分解を試みたところ、予想通り、アスコルビン酸が付加していない新規生成物が得られ、IsdG本来の生成物と考えられた。これらの生成物を大量調製し、ESI-MSおよびNMRによって構造を検証した結果、SB-CHOと同定された。
SB-CHOは、結核菌の同型酵素MhuDにおける生成物の位置異性体にあたり、その生成は昨年度までに解明したMhuD型の反応機構で説明できる。そこでMhuD反応の鍵中間体（水酸化ヘム）とIsdG複合体の反応を検討したところ、２原子酸素添加機構による開環反応が強く示唆された。また、水酸化ヘムと酸素のみの反応ではSB-CHOが選択的に生成し、還元剤の共存下ではHCHOの遊離・SBの生成が見られた。水酸化ヘム自体は同条件では還元されないため、酸素が反応した後に開環中間体が還元されることで、HCHOの遊離は制御されると考えられる。この様な生成物の制御機構は、細菌におけるHCHO合成量の調節機構としても注目される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年までに結核菌MhuDの新規反応機構をほぼ解明し、黄色ブドウ球菌IsdGでも同等の機構が期待されていた。しかし、IsdGは反応条件によって多彩な生成物を、非常に複雑なパターンで与えるため、詳細な反応機構はもちろん、その概要さえ掴めていなかった。本年度の研究でIsdG生成物の多くの構造同定に成功したことは、その概要解明に極めて重要な成果である。中でも、アスコルビン酸付加体の生成は非常に珍しい現象であり、ラジカル性の中間体の生成を示唆するだけでなく、他の酵素でも同様の付加体が得られる可能性を強く示唆する。よって、この様な人工還元剤の使用には細心の注意が必要である。生成物の同定と併せて、前年度までの研究成果・手法を活用することで、IsdG反応についても、かなり詳細な部分まで解明することに成功した。PaOタンパク質の研究については少し遅れがあるものの、既に基本的な発現系の構築を終え、発現条件や可溶化タグの最適化を進めており、次年度には十分な成果が得られると考えている。以上のことから、現在までの達成度は「概ね順調に進展している」ものと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
第一に、水酸化ヘム-IsdG複合体の開環機構を詳細に検討する。２原子添加機構の直接的な確認に加え、HCHO遊離に必要な還元当量・酸素源を決定し、生成物の切り替え機構を決定する。さらに、水酸化ヘム-MhuD（またはIsdG）複合体の結晶構造を決定することで、その特殊な反応性を探るために必須な構造情報を得る。MhuD複合体では1:1複合体の効率的な調製が課題となるが、活性部位近傍のアミノ酸変異によりヘムが１分子しか結合しない変異体を見いだしており、この変異体の結晶化・構造解析を試みる。さらに、水酸化ヘム複合体結晶に酸素を作用させて中間体構造の解明も目指す。主に酸素の付加様式や提案しているジオキセタン型中間体の構造を検証する。
第二に、PaOの大量発現系を確立し、その機構研究を進める。現在までに基本的な発現系は構築しているが、大腸菌の基本的な発現系ではPaOは不溶性タンパク質として発現される。現在までに可溶化タグの付加による可溶化には成功しているため、さらなる発現条件やタグの最適化を行い、活性型酵素の高純度精製を目指す。さらに、効率的な活性測定系を既報を参考にして構築し、酵素活性を指標に発現条件・添加物・精製方法などを最適化する。また、ICP-MSやLC-MSなどの測定によって酵素に含まれる補酵素・金属イオンを同定・定量し、基礎的な構造情報を探る。良質な酵素が得られれば、結晶化スクリーニングを行って、構造解析の可能性を検討する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた大きな理由は、今年度末に予定していた機器修理が次年度にずれ込んだことである。また、前年度の未使用額が大きかったため、今年度の繰越額も多めとなっている。今年度の使用額自体は約120万円であり、本来の計画と大差ない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰越額の約半分は予定していた修理のため、年度当初に使用する予定である。残りの半額は結晶化キットの購入や技術支援員の雇用に使用し、研究の効率的な進行を図る。
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Research Products
(8 results)
