2015 Fiscal Year Research-status Report

低発現量タンパク質の探索を可能とするフォトアフィニティーセレクション法の開発

Research Project

Project/Area Number	15K05559
Research Institution	Tokyo University of Agriculture and Technology
Principal Investigator	櫻井香里東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (50447512)
Project Period (FY)	2015-04-01 – 2018-03-31
Keywords	フォトアフィニティラベリング / 結合タンパク質 / アフィニティー精製 / 光反応基
Outline of Annual Research Achievements	有用な生物活性を示す低分子リガンドの作用メカニズムの解明には、結合タンパク質の合理的な同定法の開発が最重要である。低分子リガンドの結合タンパク質を同定するためには、複雑な細胞内タンパク質群より、特異的な結合活性を有するタンパク質を選択的にかつ効率的に検出し、単離する手法を確立する必要がある。リガンドを固定化したアフィニティーカラムを用いる従来法では、高発現量の非特異的結合タンパク質が偽陽性検出される問題が古くより未解決であり、低発現量の結合タンパク質の単離が困難である。この問題を本質的に解決するには、天然物リガンドが細胞系中でタンパク質と相互作用する際に、並行して起こる特異的・非特異的結合相互作用を識別し制御する方法論が求められる。そこで本研究では、multivalent displayによる親和性増大、遠心分離による効率的な濃縮精製および簡便な溶出を可能とする金ナノ粒子を基盤としたフォトアフィニティープローブを創製することを計画した。新規プローブの特性を利用し、結合タンパク質をワンポットでフォトアフィニティーラベリング反応と濃縮精製を行う選択的なタンパク質探索法の確立を目指した。平成27年度においては、親和性の弱いリガンドとして糖鎖リガンドをとりあげ、金ナノ粒子フォトアフィニティープローブを作成した。糖鎖金ナノ粒子フォトアフィニティープローブを用いて既知の結合タンパク質を高選択的に捕捉し、濃縮精製することに成功した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は親和性の弱いリガンドとして糖鎖リガンドをとりあげ、金ナノ粒子に固定化するための糖鎖誘導体および光反応基誘導体をそれぞれ合成し、金ナノ粒子フォトアフィニティープローブの開発を達成した。糖鎖金ナノ粒子フォトアフィニティープローブを用いて既知の結合タンパク質を高選択的に捕捉し、濃縮精製することに成功した。これより次年度の計画の推進に必要な基盤的原理と方法論が確立したため。
Strategy for Future Research Activity	当初の研究計画に従い、天然物リガンドを固定化した金ナノ粒子フォトアフィニティープローブを合成し、これらとタンパク質抽出液を用いてフォトアフィニティーラベリングを行い、結合タンパク質の検出効率や感度、選択性について解析を行う。また、特異的に検出されたタンパク質のシークエンスを同定し、新規結合タンパク質については相互作用解析を行い結合特性の検証を行う。
Causes of Carryover	当初計上した生化学解析に関わる物品費用やLC-MS/MSによるタンパク質同定を受託解析する経費を次年度以降に支出することとしたため。
Expenditure Plan for Carryover Budget	次年度使用額は、当該研究計画の実施に際して必要となる試薬や溶媒、研究器具消耗品などの物品費、委託解析経費、研究成果発表のための学会参加費用（その他経費）及び旅費として充当する。