2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K05564
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山吉 麻子 京都大学, 白眉センター, 准教授 (70380532)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | microRNA / exosome / DDS / 抗体 / 核酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、T 細胞、血小板、上皮細胞、免疫細胞や癌細胞をはじめとする多様な細胞がexosome（エキソソーム）と呼ばれる直径40-100nmの小胞を放出することにより、遠く離れた細胞まで情報を伝達する機構が見出された。とりわけ、血中に分泌されたエキソソームに含まれるmicroRNAが、ガン細胞の増殖能ならびに転移能を支配するという新たなメカニズムが示唆されており、非常に注目を浴びている。我々は、血中microRNAを標的とした新規DDS開発を目指している。血中エキソソームは体内を循環し、他の細胞に取り込まれた後、内包しているmicroRNAを放出する。エキソソームはCD63、CD9などの表面抗原を持つが、これら表面抗原を認識する抗体をコンジュゲートした核酸を開発する。このコンジュゲートを血中投与しエキソソームに付着させ、エキソソームが細胞内に導入されるに随伴してコンジュゲートも取り込まれ、エキソソーム内のmicroRNAの機能をantimiRによって阻害しようという戦略である。この様なコンセプトに基づいてエキソソーム内のmicroRNAの機能を阻害しようという手法が未だ報告されていないことから、エキソソームの表面抗原を認識する抗体をコンジュゲートした核酸（Cy5標識）を合成し、細胞培養上清に添加した後、結合したエキソソームに付随して標的細胞に送達されるか評価した。共焦点レーザー顕微鏡による観察の結果、[anti-CD63抗体：核酸]コンジュゲートの場合には細胞質にCy5の蛍光が観察されたが、コントロール分子（[anti-BSA抗体：核酸]コンジュゲート）の場合には細胞内に蛍光が観察されなかった。この結果より、エキソソームに結合したコンジュゲートが細胞内に取り込まれたことが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究のコンセプトに基づいてエキソソーム内のmicroRNAの機能を阻害しようという手法が未だ報告されていないことから、本年度はエキソソーム表面抗原を認識する抗体（anti-CD63抗体）の細胞内侵入能、、[anti-CD63抗体：核酸]コンジュゲートの細胞内侵入能ならびに細胞内局在を評価するところからスタートした。蛍光標識した抗体ならびにコンジュゲートは標的の細胞内に導入され、共焦点レーザー顕微鏡によって細胞内局在を詳細に解析することにも成功した。このステップで1番時間を要すると思われたが、予想以上に順調に研究が遂行し、特許出願も達成出来た（特顔2016-28924）。このため、自己評価を区分（１）と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
ガン細胞亢進性 microRNA に対する [anti-CD63抗体：核酸]コンジュゲートの効果を検証する。対象の１つとして、日本人の死因第１位であり、microRNA量との関連を示唆する論文が多く報告されている『ガン』を選択する。右記の表に示した様に、既に様々な進行ステージにおいて、様々なガン組織中にmicroRNAが検出されており、進行ステージのみならず初期ステージにおいても健常者と比較して有意にmicroRNA量が増加することが報告されている。この他にも、既に医学論文に掲載された既知なガン関連microRNA（PNAS, 2008 July 29, vol.105, 10513-8; PNAS, 2005 March 8, vol.102, 3627-32; Oncol Rep. 2014 May 31, 2293-7; Mol Med Rep. 2014 Apr 4; PLoS One. 2014 Apr 16, e95240; PLoS One. 2014 Mar 17, e92099; Expert Rev Anticancer Ther. 2014 Apr 14, 463-85; Biochem Biophys Res Commun. 2014 Feb 7, 199-204; Br J Cancer. 2014 Feb 18, 1001-7）を標的としたRINDA-Oligoならびに [anti-CD63抗体：核酸]コンジュゲートを合成し、ガン細胞増殖抑制能、遊走能、浸潤能などを評価する。
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[Journal Article] Development of Novel Antisense Oligonucleotides for the Functional Regulation2015
Author(s)
Ariyoshi, J., Momokawa, D., Eimori, N., Kobori, A., Murakami A., Yamayoshi, A.
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Journal Title
Bioconjugate Chemistry
Volume: 26
Pages: 2454, 2460
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Hypoxia-Specific oligonucleotide Therapeutics System with Intracellular Environment-Responsive Peptide Ribonucleic Acids (PRNAs)2015
Author(s)
Ryohei Uematsu, Hiroka Sugai, Mitsuo Asai, Masato Inagaki, Seiji Sakamoto, Satoru Ishibashi, Hiromi Kashida, Asako Yamayoshi, Yasuyuki Araki, Hiroyuki Asanuma, Takanori Yokota, Takehiko Wada
Organizer
The 42nd International Synposium on Nucleic Acids Chemistry 2015
Place of Presentation
Eagle Himeji, Hyogo, Japan
Year and Date
2015-09-23 – 2015-09-25
Int'l Joint Research
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[Presentation] Gene Silencing by Chemically Modified siRNAs Bearing Cationic Charge on 5’-End2015
Author(s)
Yu Ohno, Kanami Akaike, Yasuhiro Shinkai, Hirohumi Fujii, Ayumi Takashina, Jumpei Ariyoshi, Asako Yamayoshi, Akira Murakami, Masayuki Fujii
Organizer
The 42nd International Synposium on Nucleic Acids Chemistry 2015
Place of Presentation
Eagle Himeji, Hyogo, Japan
Year and Date
2015-09-23 – 2015-09-25
Int'l Joint Research
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[Presentation] Gene Silencing by miRNA-like siRNAs Bearing Mismatches and Bulges2015
Author(s)
Yasuhiro Shinkai, Hirohumi Fuji, Yu Ohno, Kanami Akaike, Ayumi Takashina, Jumpei Ariyoshi, Asako Yamayoshi, Akira Murakami, Masayuki Fujii
Organizer
The 42nd International Synposium on Nucleic Acids Chemistry 2015
Place of Presentation
Eagle Himeji, Hyogo, Japan
Year and Date
2015-09-23 – 2015-09-25
Int'l Joint Research
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