2016 Fiscal Year Research-status Report
翻訳後修飾ライブラリー構築を指向したヒストン合成法の開発
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15K05565
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
川上 徹 大阪大学, たんぱく質研究所, 准教授 (70273711)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | ヒストン / ユビキチン / イソペプチド / チイラン / ペプチドライゲーション / 翻訳後修飾 / DNAメチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒストンは遺伝子を収納する足場となるタンパク質で，これにDNAが巻き付くことでヌクレオソームが形成される．ヒストンは複数の部位に多様な翻訳後修飾を受け，エピジェネティックな遺伝情報の発現制御に関与している．しかし，部位特異的に修飾を施したヒストンの調製が困難なことから，個々の修飾と機能の関連は明確には理解されていない．本研究では，独自に開発したCPEライゲーション法を用いて，修飾ヒストンライブラリーを構築するための基盤となる合成法の開発を目的とする．
平成27年度までに（１）組換えペプチドをC末端セグメントに用いる修飾ヒストン合成法の開発し，C末端側Cysペプチド（組換えペプチド）と化学合成N末端側CPEペプチドとのライゲーションの後，脱硫することによって，トリメチル化リシン含有ヒストンH3およびH4の合成に成功している．また，（２）簡便なユビキチン化ヒストン調製法の開発を行い，Cys残基チオール基に1,2-アミノチオール構造を導入する2-アミノメチルチイランリンカーを開発し，簡便なイソペプチドミメティクスを調製する方法の開発し，ユビキチン化ヒストンH3ペプチドの調製に成功している．
平成28年度は，引き続き，簡便なユビキチン化ヒストン調製法の開発を継続し，次年度に想定していたユビキチン化全長ヒストンの調製を行い，ヌクレオソ－ム形成における影響やその熱安定性を検討した．また，連携研究者によってユビキチンヒストンペプチドの機能について検討が行われた．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究計画では，修飾ヒストンライブラリーを構築するための基盤となる合成法の開発を目的として，（１）組換えタンパク質を合成ブロックとするヒストン調製法の開発，（２）システイン残基を介する簡便なユビキチン化ヒストン調製法の開発，（３）固相ライゲーション法による修飾ヒストン合成法の開発，を項目として挙げている．平成２７年度は（１）組換えペプチドをC末端セグメントに用いる修飾ヒストン合成法の開発，（２）簡便なユビキチン化ヒストン調製法の開発を計画し，それぞれ（１）では組換えペプチドをC末端セグメントとして用いて，化学合成N末端側部分CPEペプチドとのライゲーションの後，脱硫することによって，トリメチルリシン含有ヒストンH3およびH4の合成に成功した．また（２）では2-アミノメチルチイランをCys残基チオール基に選択的に反応させて1,2-アミノチオール構造を導入することに成功し，続いてペプチドライゲーションによって簡便にイソペプチドミメティクスを調製する方法の開発に成功し，ユビキチン化ヒストンH3ペプチドを調製することができた．
平成28年度には上記（２）で調製に成功したユビキチン化ヒストンH3部分ペプチドを用いて，DNAメチル化酵素Dmnt1の活性に与える影響が連携研究者らによって精査され，ユビキチン化ヒストンH3部分ペプチドはDmnt1の活性を向上させ，ユビキチン化の位置によってその影響が異なることが示された．また，ユビキチン化全長ヒストンH3の調製を行い，ヌクレオソ－ム形成における影響やその熱安定性を検討した．
以上からおおむね順調に進展している．
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究計画では，修飾ヒストンライブラリーを構築するための基盤となる合成法の開発を目的として，（１）組換えタンパク質を合成ブロックとするヒストン調製法の開発，（２）システイン残基を介する簡便なユビキチン化ヒストン調製法の開発，（３）固相ライゲーション法による修飾ヒストン合成法の開発，を項目として挙げている．（１），（２）については平成２７，２８年度に基本的な方法論を確立できたと考えている．
平成２９年度は，引き続き（３）固相ライゲーション法による修飾ヒストン合成法の開発を目的として，ペプチドを固相に担持するためのリンカーを精査し，また，ペプチド主鎖構築のために，再度簡便なライゲーション法によるヒストンの全合成ルートを精査して，その情報を固相ライゲーション法へフィードバックする．本法の確立によってヒストンの機能や構造の研究に大きく貢献できるものと確信している．また，ユビキチン化ヒストンの機能と構造情報が連携研究者らの研究から進行している．本研究課題でも機能や構造情報は重要な成果となるため，引き続いてユビキチン化ヒストンの調製法の開発を進めていく．
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| Causes of Carryover |
研究はおおむね計画通りに順調にかつ効率的に進行させることができ，無駄遣いすることなく算を節約することができたため．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度になることから，無駄遣いの無いように計画し，より一層の研究の進展のために使用する．
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