2015 Fiscal Year Research-status Report
人工蛋白質を用いたヒドロキシメチルシトシン検出法の開発と脱メチル化挙動の解明
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15K05572
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| Research Institution | Doshisha University |
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Principal Investigator |
野村 章子 同志社大学, 研究開発推進機構, 嘱託研究員 (40443006)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | DNA / タンパク質 / ペプチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAのメチル化は細胞の発生や分化、細胞の癌化や様々な疾患に、また、DNAの脱メチル化は細胞の分化状態のリセットに関与していることが知られている。DNAメチル化はその機構が詳細に解明されている一方、脱メチル化にはいくつかの機構が提唱されてはいるが完全には解明されていない。
脱メチル化機構において、ヒドロキシメチルシトシンは鍵となる重要な中間体として注目されているが、その存在量は細胞によって異なり、かつ絶対量がメチルシトシンと比較して少ないため、その検出は難易度が高い。上記を鑑み、本研究はヒドロキシメチルシトシンの検出およびヒドロキシメチルシトシンを経由する脱メチル化挙動の解明を目指して、ヒドロキシメチルシトシンを認識するタンパク質を作製し、これを用いてヒドロキシメチル化DNAの検出を行う。
H27年度は、ヒドロキシメチル化DNAを作製するTETタンパク質に着目して、ヒドロキシメチルシトシンを認識する蛋白質の設計を行った。ヒドロキシメチルシトシンのヒドロキシメチル基はDNAのメジャーグルーブに位置している。いくつかのDNA-TET複合体の構造が報告されており（Xu et al., Cell, 2013, 155, 1545-1555.）、これらの知見を基にヒドロキシメチル化CpG配列の認識に必要な相互作用、および各相互作用間の効果的なネットワークを分子モデリング計算を用いて検討した。これまでの検討および種々の芳香族性アミノ酸残基や疎水性アミノ酸残基に関する検討の結果、側鎖アミノ酸残基としてチロシンが有効であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H27年度はヒドロキシメチル化DNAを認識する人工タンパク質・ペプチドの設計を行った。現在、得られた結果を分子設計にフィードバックして、人工タンパク質・ペプチドの再設計に取り組んでおり、おおむね当初の研究計画通りに進行していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
H27年度は主として、人工タンパク質・ペプチドの分子設計、特にヒドロキシメチル基を認識するアミノ酸残基の分子設計について検討したが、H28年度は本検討から得たアミノ酸残基を導入した人工タンパク質・ペプチドとDNAとの相互作用を検討する。具体的には、ゲルシフト実験や蛍光色素等のラベルを導入した人工タンパク質・ペプチドとDNAを用いた蛍光観察を行う。各実験から標的DNAとの相互作用を定量化し、評価する。併せて、NMR等の分光学測定から構造や相互作用に関する知見を得て分子設計にフィードバックし、人工タンパク質の機能向上を図る。
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| Causes of Carryover |
H27年度は主として分子設計の検討を行い新たな知見を得た。これを基に更に詳細な検討を進めるため、当該部分の研究実施計画を延長して次年度（H28年度）も引き続き設計と改良を行っていくこととした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H27年度の研究実施計画の一部を延長して次年度にも行うため、使用予定であった未使用金額分を次年度（H28年度）の当該実験に使用する。
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