2016 Fiscal Year Research-status Report
人工蛋白質を用いたヒドロキシメチルシトシン検出法の開発と脱メチル化挙動の解明
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15K05572
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| Research Institution | Doshisha University |
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Principal Investigator |
野村 章子 同志社大学, 研究開発推進機構, 嘱託研究員 (40443006)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | DNA / タンパク質 / ペプチド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNAのメチル化は細胞の発生や分化、細胞の癌化や様々な疾患に、また、DNAの脱メチル化は細胞の分化状態のリセットに関与していることが知られている。DNAメチル化はその機構が詳細に解明されている一方、脱メチル化にはいくつかの機構が提唱されてはいるが完全には解明されていない。
脱メチル化機構において、ヒドロキシメチルシトシンは鍵となる重要な中間体として注目されているが、その存在量は細胞によって異なり、かつ絶対量がメチルシトシンと比較して少ないため、その検出は難易度が高い。上記を鑑み、本研究はヒドロキシメチルシトシンの検出およびヒドロキシメチルシトシンを経由する脱メチル化挙動の解明を目指して、ヒドロキシメチルシトシンを認識するタンパク質を作製し、これを用いてヒドロキシメチル化DNAの検出を行うことを目指す。
前年度は、ヒドロキシメチル化DNAを作製するTETタンパク質に着目して、ヒドロキシメチル化CpG配列の認識に必要な相互作用、および各相互作用間の効果的なネットワークを分子モデリング計算を用いて検討し、ヒドロキシメチルシトシンを認識する蛋白質の設計を行った。
H28年度は上記分子設計の結果を基にペプチドおよびタンパク質を作製した。具体的には標的DNAとのゲルシフト実験、およびゲノムDNAを用いた蛍光偏光測定を行い、得られた結果をフィードバックして水素結合等の複数の相互作用の設計を検討し、分子設計の最適化を行った。さらに、細胞内でのヒドロキシメチル化DNA観測の予備実験として蛍光ラベルを細胞内に導入し、共焦点レーザー顕微鏡（共同利用機器）を用いて条件検討を行っており、現在も進行中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
H28年度は、タンパク質およびペプチドとDNAとの相互作用解析を行い、得られた結果をフィードバックして分子設計の最適化を行った。さらに、翌年度の予備実験として細胞内に導入した蛍光ラベルの検出の条件検討にも取り組んでおり、おおむね当初の研究計画通りに進行していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までは主として、タンパク質・ペプチドとDNAとの相互作用について検討したが、H29年度は本検討から得たタンパク質・ペプチドに蛍光プローブを導入して、細胞内におけるDNAとの相互作用を共焦点レーザー顕微鏡を用いて検出・観測する。検出条件はH28年度から引き続いて検討・最適化し、標的に応じた複数のラベルの同時検出を可能とするため、細胞内の局所的な蛍光スペクトル測定およびスペクトル解析を行う。
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| Causes of Carryover |
H28年度は主として分子設計から得られたペプチドおよびタンパク質の構造や分光学的性質、DNAとの相互作用について検討を行った。得られた結果をもとにさらに詳細な検討を進めるため、当該部分の研究実施計画を延長して翌年度（H29年度）も引き続きペプチドおよびタンパク質の改良を行っていくこととした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
H28年度の研究実施計画の一部を延長して翌年度にも行うため、使用予定であった未使用金額分を翌年度（H29年度）の当該実験に使用する。
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