2018 Fiscal Year Annual Research Report
Concerted proton/electron transfer mechanism in cofactor-dependent enzyme
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15K05573
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| Research Institution | Osaka Medical College |
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Principal Investigator |
林 秀行 大阪医科大学, 医学部, 教授 (00183913)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村川 武志 大阪医科大学, 医学部, 助教 (90445990)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 触媒反応機構 / キノタンパク質 / トーパキノン / プロトン移動 / 電子移動 / 解離基 / pH依存性 / 遷移相速度論 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Arthobacter globformis 銅アミン酸化酵素（AGAO）について，本研究全体のの骨子である「プロトン・電子移動の協同的制御機構」を解明するための中心的な情報である，種々のプロトン化状態における反応解析を行った．嫌気的条件下，種々の pH において基質フェニルエチルアミンと AGAO を反応させ，スペクトル変化をフォトダイオードアレイを装備したストップトフロー分光器を用いて追跡し，得られたスペクトル変化をグローバル解析に供し，遷移相速度論的解析を行った．
その結果，それぞれの pH において遊離酵素，基質シッフ塩基，生成物シッフ塩基，還元型，およびセミキノン型の各中間体を同定し，それらの間の相互転換の速度定数を決定することができた．これらの速度定数は顕著な pH 依存性を示し，還元型とセミキノン型の相互転換は正逆方向とも pH の上昇に伴って著しく減少しており，一方，それ以外の過程の速度定数はいずれも正逆方向とも pH の上昇に伴って上昇していた．特筆すべきことは，基質シッフ塩基と生成物シッフ塩基の相互転換のいずれの向きの速度定数も，pKa = 6.0 から 6.5 の解離基が脱プロトン化した形が活性分子種となる pH 依存性を示し，Asp298 の一般塩基触媒としての機能を初めて実際の反応の上で証明することができた．また，生成物シッフ塩基の加水分解の過程の pH 依存性からも，Asp298 が水分子の攻撃の一般塩基触媒として働くことが示され，Asp298 の触媒基としての多機能性を示すことができた．また，還元型とセミキノン型の相互転換の速度定数は高 pH 領域でほとんど 0 に近づくことから，この過程が触媒反応の本筋の過程ではなく，脇道の袋小路の過程であることが判明した．以上のことは現在進行中の中性子線解析の結果の解釈において重要な情報を提供した．
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