2015 Fiscal Year Research-status Report
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15K05575
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| Research Institution | Konan University |
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Principal Investigator |
中野 修一 甲南大学, フロンティアサイエンス学部, 教授 (70340908)
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| Project Period (FY) |
2015-10-21 – 2018-03-31
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| Keywords | RNA / 構造安定性 / イオン液体 / アルキルアンモニウムイオン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はイオン液体を利用した核酸テクノロジーを創製することを目的としており、今年度はまず、第四級アンモニウムイオンがRNA塩基対の熱力学的安定性に与える影響を調べた。アルキル鎖長がメチル基からヘキシル基までのテトラアルキルアンモニウムイオン水溶液の調製を試みたが、テトラヘキシルアンモニウムイオン水溶液では相分離が生じたため本実験に適さないことがわかった。そこで、メチル基からペンチル基までのテトラアルキルアンモニウムイオン存在下でRNA二重鎖構造の安定性を調べ、グリシンベタインやトリメチルアミン-N-オキシド（TMAO）を用いた場合との比較を行った。ポリマーRNAとオリゴマーRNAの熱融解曲線を解析した結果、これらの嵩高いイオンはそのサイズに応じてRNAの塩基対構造を安定化あるいは不安定化させることが明らかになった。サイズが大きなイオンは不安定化作用を示し、その不安定化度はイオンのサイズと濃度によって変えられることがわかった。一方で、円二色性分散計（CD）スペクトルの測定結果から、イオン濃度が100~200 mMを超えると一本鎖RNAのコンフォメーションが大きく変化してしまうことが見出され、RNA構造をコントロールするには中程度の濃度領域（100 mM前後）が適していることがわかった。さらに、オリゴマー核酸を用いて熱力学的パラメータを算出し、アルキルアンモニウムイオンがRNA構造を不安定化させる原因となっている熱力学的な因子を明らかにすることができた。このように、イオンサイズの違いによるRNAの構造と安定性への影響の違いを明らかにし、次年度以降に実施する機能性核酸を対象とした研究に利用できる実験条件を絞り込むことができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度は、イオン液体を利用した核酸テクノロジーを創製するのに必要な熱力学的データを得ることを目的とし、核酸研究において金属イオン以外の選択肢としてイオン液体化合物を使う際の問題点を明らかにする試みを行った。様々なサイズのアルキルアンモニウムイオンについてRNAの構造と安定性への影響を定量的に評価し、RNA構造をコントロールするのに適したイオンのサイズと濃度を明らかにすることができた。当初計画していたホスホニウム塩やイミダゾリウム塩を用いた検討は実施できなかったものの、アルキルアンモニウムイオンのサイズと濃度変化の効果を明らかにできたことは今後の研究の進展にとって非常に重要である。また、今年度に得られた熱力学データは、アルキルアンモニウムイオンの作用メカニズムの解明につながる重要な知見を与えるものであった。このような、サイズの大きなカチオンを使って得られた熱力学データは、核酸とカチオンの結合に関する基礎理論の構築に貴重な情報でもある。追加採択研究であることによる研究開始の遅れの影響があるものの、今後の機能性核酸を対象とした研究に役立つ知見を得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずは、今年度に行った安定性の評価実験をDNA構造に対して実施するとともに、非塩基対部位を含む様々な構造体に対する影響を明らかにする。具体的には、インターナルループ構造やヘアピン構造を試みる。また、高次構造に対する影響を解明するために、RNAの高次構造（シュードノット構造など）に対する実験も予定している。
一方で、今年度に得られた結果に基づいて、様々な機能性核酸に対するイオン液体化合物の影響を明らかにしていく。まずは、バイオセンサーのプローブ分子として注目されている、RNA切断活性をもつリボザイム（ヌクレアーゼリボザイムやリガーゼリボザイムなど）への影響を調べる。リボザイム活性は、金属イオン、基質との結合効率、高次構造の形成能力に大きく左右されることを利用して、リボザイム活性をアルキルアンモニウムイオンや他のイオン液体化合物によってコントロールする方法を開発する。とくに、バイオセンサーへの利用を視野に入れて、ターンオーバー活性の向上と金属イオンに対する応答性の向上を目指す。アルキルアンモニウムイオンとは骨格構造が異なるイオン液体化合物（ホスホニウム塩、イミダゾリウム塩など）や、タンパク質やペプチド、ポリアミン化合物などを用いた検討も計画している。また、DNAチップやモレキュラービーコンに用いられるDNAプローブによる鎖交換反応についても検討を始める。この結果とリボザイム実験から得られるデータと比較することで、核酸に対するイオン液体化合物の効果の一般性を明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
追加採択の通知をいただいたのが10月下旬であったため、本研究の開始が大きく遅れたことによる予算の未執行が発生した。とくに、今年度中に実施を予定していた機能性核酸を使った検討を行うことができなかったため、この実験に用いる蛍光測定装置の購入を先送りした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度に購入する予定であった蛍光測定装置を購入する。他の経費は、当初の計画通り消耗品の購入などに充てる。
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