2016 Fiscal Year Research-status Report
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15K05575
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| Research Institution | Konan University |
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Principal Investigator |
中野 修一 甲南大学, フロンティアサイエンス学部, 教授 (70340908)
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| Project Period (FY) |
2015-10-21 – 2018-03-31
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| Keywords | DNA / RNA / リボザイム / イオン液体 / アルキルアンモニウムイオン / 融解温度 / 塩基対部位 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、アルキルアンモニウムイオンが様々な大きさの非塩基対部位を含むDNA構造体に与える影響について検討を行った。昨年度に、100 mM前後の濃度のテトラブチルアンモニウムイオン（TBA）とテトラペンチルアンモニウムイオン（TPeA）がRNA構造の制御に適していることを見出していたことから、今回は100 mM TPeA条件下で様々なDNA構造の熱安定性を測定した。その結果、TPeAは小さなサイズのループ構造を不安定化させるのに対して、大きなサイズのループ構造を安定化させることが見出された。TPeAの濃度依存性についても調べたところ、濃度上昇に伴ってフルマッチ構造や小さなループ構造は不安定化するのに対して、ループの大きさが5（ヘアピンループ）または10（バルジループとインターナルループ）を超える構造体は安定化することが示された。この結果から、TPeAはその嵩高さのために塩基対部位に結合できないが、大きなサイズのループ部位（一本鎖部位）には静電相互作用で結合しDNA構造を安定化させると考えられる。次に、機能性核酸の機能向上を試みるために、RNA切断活性をもつハンマーヘッドリボザイム（ループ部位をもつRNA構造体）の酵素活性への影響を調べた。反応速度解析の結果、アルキルアンモニウムイオンはリボザイムのターンオーバー活性を最大で100倍以上向上させることが示された。また、別の種類のイオン液体化合物（ホスホニウム塩、イミダゾリウム塩など）の効果も調べ、ターンオーバー活性を大きく向上させる化合物を見出すことができた。さらに、標的DNA二重鎖に相補的な蛍光標識化DNAプローブを設計し、DNA鎖交換反応に与える影響についても検討を開始した。現在までに、TPeAはDNA鎖交換反応を促進させる作用があることが見出され、他のイオン液体化合物についても検討を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度と今年度に実施した実験で、DNAとRNAの分子機能を制御するのに適したアルキルアンモニウムイオンのサイズと濃度を明らかにした（100 mM程度のテトラブチルアンモニウムイオンとテトラペンチルアンモニウムイオン）。比較的長いアルキル鎖をもつアンモニウムイオンは金属イオンにはない興味深い性質（一本鎖核酸への結合、塩基対構造の不安定化、ループサイズが大きな構造体の安定化など）を有しており、大きなカチオン性分子は機能性核酸の制御に有効であると思われる。実際に、リボザイムの酵素活性に与える影響を検討したところ、大きなサイズのアルキルアンモニウムイオンやその他のカチオン性イオン液体化合物はハンマーヘッドリボザイムのターンオーバー速度を大きく向上させることが見出された。一般に、分子センシング材料として有望な小型リボザイムのターンオーバー速度は著しく遅く、ターンオーバー活性を向上させるには、リボザイム・基質複合体の安定化と酵素・反応産物複合体の不安定化という相反する状況をつくり出すことが望ましい。これは、核酸研究に広く用いられている金属イオンでは不可能である。また、大きなサイズのアルキルアンモニウムイオンはDNA鎖交換反応を促進させることが明らかになり、DNAチップやモレキュラービーコンの機能向上につながる知見を得ることができた。このように、本研究によって核酸研究におけるイオン液体化合物の有用性が示されつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
イオン液体を利用した新規核酸テクノロジーを創製するために、今年度に引き続いて各種イオン液体化合物による機能性核酸の分子機能の向上を試みる。機能性核酸として、ハンマーヘッドリボザイムとDNA鎖交換プローブに加えて、リガーゼ活性をもつRNAとDNA、そしてDNA四重鎖の検討を新たに予定している。リガーゼ活性をもつ核酸に対してはRNA連結反応効率、四重鎖構造体に対しては金属イオンに対する応答性を調べる。さらに、リボザイムを利用した金属イオンセンサー（バイオセンサー）の高感度化についても検討を行う。また、分子クラウディング環境は、核酸と金属イオンの間の静電相互作用を強化することが見出されていることから、ポリエチレングリコールや有機溶媒を用いて分子クラウディング環境をつくり出し、イオン液体化合物の効果を高めることができないかを検討する。このように、様々な視点からイオン液体化合物の利用を試みる予定である。
以上の研究を進める一方で、アルキルアンモニウムイオンや他のイオン液体化合物の作用メカニズムの解明も試みる。核酸構造の安定性への影響のほかに、ミクロ相分離や排除体積効果によって核酸鎖が濃縮する効果について調べ、核酸に対するイオン液体化合物効果の一般性を明らかにしていく。また、タンパク質やポリアミン化合物は比較的大きなカチオン性分子であることから、これらの分子が核酸の構造安定性や分子機能に与える影響も調べ、イオン液体化合物による効果と比較することでその作用メカニズムの解明に役立てる。
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| Causes of Carryover |
本研究課題は追加採択であり、研究開始が大きく遅れたため、今年度に計画していた実験の一部を実施することができなかった。研究開始の遅れは取り戻しつつあるものの、未執行の予算が残ってしまうという状況である。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度に生じた残額は、今年度に実施できなかった実験を行うための消耗品の購入などに充てる予定である。
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