核内受容体ＬＲＨ－１による転写調節の分子メカニズム解明

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 15K05578
• Research Institution: High Energy Accelerator Research Organization
• Principal Investigator: 湯本 史明 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 特任准教授 (30360150)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: LRH-1 / 転写因子 / X線結晶構造解析 / X線溶液散乱解析

Outline of Annual Research Achievements

ヒトは48種の核内ホルモン受容体遺伝子をもち、それぞれが生理活性リガンドによる転写制御を介し、生体機能を支えている。これらの核内受容体ファミリーの内、NR5AサブファミリーのメンバーであるLiver Receptor Homogolue-1(LRH-1、遺伝子名NR5A2)は肝臓、膵臓、小腸、卵巣、乳腺などの発生の制御に関わっている。また、胚性幹細胞中では多能性因子であるOct4の発現制御を行うといったように初期発生においても重要な役割を担っていることが知られている。また、LRH-1は膵臓癌、乳癌の発生にも関わっていることが報告されてきており、創薬ターゲット分子と考えられている。

また、核内受容体はN末端からN末端ドメイン（N-terminal domain, NTD）、DNA結合領域（DNA binding domain, DBD）、リンカー部分と考えられるヒンジ領域、そして、ホルモン結合ドメイン（Ligand binding domain, LBD）から構成されている。ヒトLRH-1は541アミノ酸残基から構成され、ジンクフィンガー型のDNA結合モチーフだけでなく、Ftz-F1モチーフと呼ばれているモチーフの両方がレスポンスエレメントの結合に関わっている。これまでに、DBDやLBD単独での構造解析は行われてきたものの、全長としての構造構造はNR5Aサブファミリー全てのメンバーにおいて行われておらず、全長分子がレスポンスエレメントDNAに結合した際に、それぞれのドメインがどのような位置関係にあるのかはわかっていない。
このLRH-1について、X線結晶構造解析やX線溶液散乱解析、電子顕微鏡解析等の手法を使って研究を進めている。本年度は、4つのドメインからなる全長ヒトLRH-1とレスポンスエレメントDNAとの複合体としてサンプルの調製法を改善することができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

全長ヒトLRH-1とレスポンスエレメントDNAとの複合体として、構造解析用サンプルの調製を進めてきていたが、わずかながら目的タンパク質以外の高分子量背タンパク質の混入とヒンジ領域での切断と推測される分子内切断が観察されてきたため、結晶化やX線溶液散乱解析を適用するために、これらの問題点の解決を試みた。ヒトLRH-1をコードする遺伝子をpRSF-2 Ek/LICにTEVプロテアーゼ消化部位を加えた形で挿入した発現系を用い、大腸菌BL21(DE3)Starを宿主細胞として、タンパク質生産を行った 。回収した大腸菌細胞について、菌体破砕後の遠心時間、Niカラムと混合およびインキュベーション時間、カラム洗浄、溶出までの時間について可能な範囲で迅速化をはかり、Niカラムから溶出した。これまでにも複合体として解析用サンプルの調製はできていたものの、それらは全て精製用タグであるHis-6タグを含むN末端領域は残したままゲルろ過カラムに通し、目的タンパク質サンプルとしてきていた。しかしながら、本年度の検討によって、TEVプロテアーゼによってタグを切断し、より精製度が高く、精製用タグ等の余分な配列を持たないタンパク質を調製することができるようになった。さらに、これまでに論文報告例のあるLRH-1の相互作用因子であるbeta-catenin全長分子、PRMT-1全長分子のタンパク質調製系についても単一バンドとしての精製方法を確立することができた。

Strategy for Future Research Activity

このようにして確立したより精製度の高いヒトLRH-1全長分子を用いて、X線溶液散乱解析を試みたいと考えている。また、LRH-1-DNA複合体に対して、LxxLLモチーフをもつコレギュレーター（コアクティベーターやコリプレッサー）などの相互作用タンパク質由来のペプチド（例えばDAX-1由来ペプチド）をLRH-1 LBDのAF2サイトと呼ばれる相互作用部位に結合させた３成分タンパク質-DNA-ペプチド複合体を調製することによって、さらに複合体の安定化を図り、X線溶液散乱解析、さらにはX線結晶構造解析を目指して結晶化を試みたい。この試みにおいては、DNA2重鎖の長さについてスクリーニングを行う必要があると考えている。最短では、DBDの結晶構造解析が行われていた12ベースペア（bp）と考えられるが、全長LRH-1の場合にはより長い鎖を使う必要があると考えている。これまでの実験から24bpのDNA2重鎖を使ってサンプル調製を行うことが多かったが、今後は5’側に12bp程度、または3’側に12bp程度延長させるサンプルも調製し、24bpのDNAのみならずそれぞれ36bpのDNAを結合したサンプルを調製し、これら3種のサンプルについて、X線溶液散乱とさらにはCryo-Electron Microscopy解析を適用したいと考えている。Cryo-EMではDNAおりがみと呼ばれるフレームワークを利用する方法があり、これらの技術を取り入れ、LRH-1レスポンスエレメントをフレームに導入したサンプルについて、LRH-1-DNAおりがみの複合体を調製し、Cryo-EM解析を試みたいと考えている。

Causes of Carryover

LRH-1全長サンプルのより高純度での大量調製法の確立において当初の予定よりは時間がかかっており、DNAレスポンスエレメントを調製するためのDNAオリゴの使用量が見積もりよりも少なかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

年度の最後の段階でより精製度の高いサンプル調製法の確立を行うことができ、次のステップとして大量調製段階に入ることから、この調製において、DNAレスポンスエレメントを調製するDNA購入費としてしようしたいと考えている。

Research Products

• [Int'l Joint Research] UCSF(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: UCSF