2016 Fiscal Year Research-status Report
核内受容体ＬＲＨ－１による転写調節の分子メカニズム解明
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15K05578
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| Research Institution | High Energy Accelerator Research Organization |
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Principal Investigator |
湯本 史明 大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 特任准教授 (30360150)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | LRH-1 / NR5A2 / リガンド結合領域 / X線結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Liver Receptor Homolog-1（LRH-1, NR5A2）は、48種からなるヒト核内受容体ファミリーの一種であり、肝臓、膵臓、小腸、卵巣、乳腺等の発生における遺伝子発現制御に関わっている。また、胚性幹細胞においては多能性維持因子であるOct3/4の遺伝子発現制御を行うなど、初期発生においても重要な役割を担っていることが知られている。また、LRH-1は膵臓癌、乳癌の発生にも関わることから、創薬ターゲットとして薬剤候補化合物のスクリーニングが進められている。
LRH-1はN末端からN末端ドメイン、ZnフィンガーとFtz-F1モチーフと呼ばれる領域からなるDNA結合ドメイン（DNA Binding Domain, DBD）、ヒンジ領域とよばれるリンカードメインそしてリガンド結合ドメイン（Ligand Binding Domain, LBD）によって構成されている。ヒトLRH-1については、DBDはDNAとの複合体として、またLBDについてはコレギュレーターとよばれる因子に由来するLRH-1 LBD結合モチーフとの複合体として結晶構造が決定されてきている。またLRH-1 LBDについては我々がβカテニンのアルマジロリピート領域との複合体として決定されている。
このような中で、我々はLRH-1全長のタンパク質について発現精製を行い、レスポンスエレメントDNAに由来する2重鎖断片との複合体調製を行い、精製用のヒスチジンタグをTEVプロテアーゼによって除去することができ、LRH-1全長-DNA複合体の大量調製が可能になった。また、LRH-1 LBDと阻害化合物との複合体の結晶構造解析を行うために、LRH-1 LBD Cys-liteの調製を行い、LRH-1の相互作用分子であるDax-1に由来するペプチド、さらには阻害化合物との複合体として結晶化スクリーニングを進めてきた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
LRH-1 LBDの結晶構造解析は、大腸菌を使ったタンパク質の大量調製系を用いて行われてきた。これまでにDLPCやフォスファチジルイノシトールリン酸がLRH-1のリガンド結合ポケットに結合し、作用することは知られているものの、実際に生体内で作用するLRH-1の生理的リガンドは確定されていない。またこのようなリン脂質の結合については、大腸菌を用いて調製されたLBDの結晶構造解析においてLBDのリガンド結合ポケット内に大腸菌に由来すると考えられるフォスファチジルグリセロールが結合していたことをきっかけとして、結晶構造解析と質量分析によって明らかとなった。
本年度は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のロバート フレッテリック教授らと共同で、このLRH-1 LBDと阻害化合物との複合体の結晶構造解析を行うべく、サンプル調製と結晶化スクリーニングを行った。LRH-1 LBDの表面のCysをSerに変異させたCys-LiteバージョンのLBDを調製し、タンパク質としてmgオーダーで調製できる系を確立した。また、上述のように大腸菌で調製したLBDはフォスファチジルグリセロールを結合した状態で精製され、除くことは困難であることから、リフォールディングを行うこととした。カルシウム結合タンパク質で古くからアポ型タンパク質を調製する際に用いられているTCA沈殿を利用したリフォールディング法が存在するが、この方法をLRH-1 LBD Cys-liteに適用し、LRH-1 LBD Cys-liteのアポ体の調製を行った。このサンプルに、Dax-1に由来するLRH-1 LBD結合ペプチドを結合させ、フレってリックグループで同定された阻害化合物と混合したものを調製し、KEKの大規模結晶化装置を用いて、共結晶化条件のスクリーニングを進めてきた。
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| Strategy for Future Research Activity |
LRH-1 LBD Cys-LiteとDax-1由来ペプチドと化合物との複合体として結晶化スクリーニング可能な質と量のサンプルが調製できるようになったことから、複数のLRH-1 阻害化合物について共結晶化の試みを続けていく。
また、LRH-1全長-DNA複合体の大量調製が可能であることから、このサンプルにLRH-1結合性ペプチド、βカテニン、あるいはDax-1といったLRH-1と相互作用することが確認されている分子との複合体調製も試み、X線小角散乱解析、クライオ電子顕微鏡解析を行うことによって、LRH-1全長としての構造情報を得たいと考えている。このLRH-1全長には、前述の通り、ヒンジ領域と呼ばれる天然変性領域が存在していることから、複合体全体としてより安定化することが必要である可能性もある。したがって、LRH-1全長-DNA複合体をより安定化する分子を含む複合体を調製することによって、より構造解析に適したサンプル調製を試みたいと考えている。このプロセスの中で、安定な複合体調製ができた際には、大規模結晶化装置を用いて、結晶化条件の探索を行い、X線結晶構造解析を進めていきたい。
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| Causes of Carryover |
LRH-1 LBDのサンプル調製や結晶化実験をより多く試みることになったことから、LRH-1全長分子のサンプル調製におけるレスポンスエレメント用オリゴヌクレオチドの使用が減り、残金が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
全長LRH-1分子の調製においてオリゴヌクレオチドを購入し、使用したいと考えている。
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