2015 Fiscal Year Research-status Report
水の構造化による細胞の冷温保存における障害低減効果
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15K05840
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
氏平 政伸 北里大学, 医療衛生学部, 准教授 (70286392)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 水構造化 / キセノンガス / ガラス表面 / 薄膜液 / 細胞障害低減効果 / 冷温保存 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
移植治療や再生医療における需給バランス確保のために，半永久的保存法である凍結保存に耐えられない細胞・組織・臓器が0～4℃で冷温保存されている．しかし，冷温では一定の代謝抑制効果が得られる反面，物質不均衡による細胞障害が起こるので保存可能期間が非常に短いのが現状である．従って，物質不均衡の抑制に有効な手段が有れば保存可能期間を延ばすことが出来る．本研究では，水の構造化による物質輸送の抑制効果に着目し，キセノン（Xe）ガス加圧と固体表面を利用した薄膜液の２つのアプローチによる冷温障害低減効果を細胞レベルで明らかにすることを目的とする．
本年度は，第1に，単層培養ヒト皮膚繊維芽細胞の冷温保存におけるXeガス加圧による細胞障害低減効果に及ぼす温度の影響を調べた．その結果，－2℃～4℃の温度範囲，Xeガス加圧圧力が0.5MPaにおいて，4℃が最も効果的な温度であることが示唆された．また，特に4℃については，先行研究（前科研費課題との共通データ）により細胞障害低減効果の時間依存性が調べられており，Xeガスの最適圧力が0.5MPaであることが示唆されていた．そこで，本年度は細胞障害低減効果の時間依存性のデータ数を増やし検討した結果，少なくとも4℃では0.5MPaが最適であることが明らかとなった．このことは前課題の成果と合わせて論文発表された．
第2に，2枚のガラス板に細胞と培養液（薄膜液）を挟み込むことで細胞内外における水構造化を実現させることによる細胞の冷温保存（4℃）における障害低減効果の有無について保存時間をパラメータとして調べた．その結果，板状ガラスに皮膚繊維芽細胞と共に溶液を挟み込んで水を構造化させることにより、冷温による細胞障害を低減することが示唆された．また，水構造化の程度については薄膜液の厚みと凍結温度の関係を実験により求めることで確認することが出来た．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．キセノンガス加圧実験
当初予定していたのは，Xeガスを任意の温度（0～4℃）と圧力（0～1.0MPa）で加圧し一定時間（6～24h）保存した後に細胞活性を評価し，加圧しない場合と比較し，細胞障害低減効果のXeガス添加圧力依存性と温度依存性を検討することであった．実際には，温度範囲が－2～4℃，圧力が0.4と0.5MPa，時間は18hで冷温保存実験を行い，細胞障害低減効果の温度依存性がある程度明らかとなった．よってほぼ予定通りと言える．また，Xeガスを試料に加圧した状態で観察可能な透明耐圧容器を用いて各条件における水の構造化の程度を探ることを予定していた．しかし，構造化の程度を探るのは最適温度（圧力）条件が明らかになってから遂行すべきことであるため本年度は取り上げなかった．
２．固体表面を利用した薄膜液の実験
本年度の予定は，最小限度の厚みを得るためカバーガラスを基質として用いて一定の数の細胞を単層培養し，培養液膜中で同じカバーガラスで挟み込んだ試料と挟まない試料で冷温保存を行い，復温後の細胞活性測定により細胞障害低減効果が得られるかどうか検討することであった．これは，細胞障害低減効果が示唆されたためデータ数が少ないもののほぼ予定通りであった．細胞を使わずにカバーガラス2枚に封じ込んだ培養液で液厚をパラメータとして凝固点測定から各条件における水の構造化の程度を探る実験も予定されていた．これも，ある程度明らかとなったことから，これもほぼ予定通りと言える．
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| Strategy for Future Research Activity |
１．キセノンガス加圧実験
本年度一定の成果は得られたものの細胞障害低減効果の温度依存性に関するデータ数が足りないので増やすと共に，－2℃よりも低温側に温度範囲の拡大を図り，18hよりも長い保存時間のデータも取る予定である．最終的に最適温度条件を明らかにしたい．また，各温度においてキセノンハイドレート生成を抑制する手段を探る予定である．
２．固体表面を利用した薄膜液実験
カバーガラスで挟み込んだ薄膜液による細胞の低温障害低減効果は示唆されたものの，試料作成時の薄膜液の厚みのコントロールが難しく試料作製を含めた一連の操作方法が確立されていない．そこで，今後は方法を確立することと，保存時間を延ばす（24h以上）ことを行う予定である．
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| Causes of Carryover |
キセノンガスの残量が少なくなったため購入（約20万円）しようとしたが残高不足で購入できなかった．また，少しでも残しておけば次年度予算が使えるようになるまでに使うことが出来れば便利であると考えたため．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
来年度分と合わせキセノンガス購入に当てたい．または，本年度と同様の消耗品の購入に使いたいと考えている．
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